[發明專利]一種基于熒光PCR技術檢測ESR1基因突變的方法

有效

• 申請號: 201410315487.2
• 申請日: 2014-07-03
• 公開（公告）號: CN104120178A
• 公開（公告）日: 2014-10-29
• 發明（設計）人: 戴鵬高;張潔;陳超;趙瑩;鄒暉
• 申請（專利權）人: 陜西佰美基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 西安智邦專利商標代理有限公司 61211
• 代理人: 胡樂

技術領域

本發明涉及一種檢測ESR1基因突變的方法。

背景技術

人類雌激素受體α(Estrogen?receptor?alpha,ESRα)由ESR1(Estrogen?Receptor1)基因編碼。ESRα與其配體雌激素結合后，可激活細胞內一系列的細胞生物學效應。ESR1基因的突變和異常表達均與乳腺癌等疾病的發生有關。

ESR1基因最為常見的突變類型為Y537S,Y537C,Y537N以及D538G。這些突變使得ESRα的構象改變，其可在不與雌激素結合的情況，表現為持續性激活狀態。

目前已報道的應用于檢測ESR1突變的方法的為直接測序技術和二代測序技術。其中直接測序技術成本低，準確性高，然而需要PCR后處理步驟，既操作復雜，又容易發生污染，產生假性結果；且該方法靈敏度不足，不能完全適應臨床樣本的復雜情況。二代測序技術靈敏度高，但其依賴于昂貴的儀器和分析軟件，檢測成本大大增加，難以作為普適技術。

等位基因特異性PCR(Allele-specific?PCR)，也稱為ARMS(Amplification?Refractory?Mutation?System)技術，是一種利用序列特異性引物對模板進行選擇性擴增而達到檢測基因突變的方法。其核心原理是根據PCR過程中DNA聚合酶引導的引物延伸從引物的3′末端開始，而引物3′末端的堿基與模板的互補配對程度強烈影響聚合酶的識別作用和PCR反應的進行:若這個堿基與模板正常互補配對(A-T,G-C)，則引物可以不間斷延伸，PCR得以高效進行，得到完整的產物；反之，若這個堿基與模板非正常配對，則引物的延伸受到阻滯，PCR效率大大降低。故將與突變位點對應的堿基放置在引物的3′末端，同時在必要時人為引入其他堿基的錯位配對，便可以達到選擇性擴增某種等位基因的作用。將ARMS技術與以TaqMan探針為基礎的熒光PCR結合起來，便可以達到快速準確檢測基因突變的目的。

發明內容

為了克服傳統檢測技術的缺陷，本發明提供一種基于熒光PCR快速準確檢測ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及D538G四種突變的方法，即通過設計等位基因特異性引物，結合TaqMan探針技術，在一個反應中快速準確檢測ESR1基因突變。

為實現以上發明目的，本發明的基本技術方案如下：

基于熒光PCR技術檢測ESR1基因突變的方法，用于非疾病診斷目的，包括以下環節：

(1)引物及熒光探針設計：

針對ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及D538G這四種突變分別設計等位基因特異性引物，均作為上游引物，序列如下:

Y537S:5’-GAACGTGGTGCCCCTCcC-3’

Y537C:5’-GAACGTGGTGCCCCTgTG-3’

Y537N:5’-AGAACGTGGTGCCCCaCA-3’

D538G:5’-ACGTGGTGCCCCTCTATtG-3’

其中小寫字母表示的堿基為人為引入的錯配，以增強檢測的特異性；

針對四種突變設計一條共通的下游引物，序列如下:

Rp:5’-CACGGCTAGTGGGCGC-3’

針對四種突變設計一條共通的TaqMan熒光探針，其序列及修飾如下:

Probe:5’-FAM-CTGGAGATGCTGGACGCCCAC-BHQ2-3’

針對ALB基因設計的序列特異性引物探針組合，作為內質控體系，其序列如下:

ALB?Fp(上游引物):5’-TGTTGCATGAGAAAACGCCA-3’

ALB?Rp(下游引物):5’-GTCGCCTGTTCACCAAGGAT-3’

ALB?Probe(探針):5’-HEX-AGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACA-BHQ2-3’

其中，FAM為6-carboxyfluorescein；HEX為6-carboxy-hexachlorofluorescein；BHQ2為Black?Hole?Quencher-2；

(2)模板的制備:提取待測樣本的基因組DNA；

(3)建立熒光實時定量PCR反應體系：