[發(fā)明專利]鱖魚彈狀病毒的檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410315460.3
• 申請日: 2014-07-02
• 公開（公告）號: CN104032038A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發(fā)明（設計）人: 雷燕;張會軍;劉婉;王惠儒;張文文
• 申請（專利權）人: 廣州金水動物保健品有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明屬于水產動物病原的檢測與診斷技術領域，涉及一種鱖魚彈狀病毒的檢測方法，特別是一種采用逆轉錄-聚合酶鏈式反應(簡稱RT-PCR)技術檢測鱖魚彈狀病毒的方法。?

背景技術

近年來，廣東省的佛山、中山，山東的濟寧以及湖北等地的烏鱧、鱖魚、加州鱸魚養(yǎng)殖場爆發(fā)大規(guī)模的流行性疾病，造成巨大的經濟損失。實驗室從細菌學和病毒學兩方面對患病魚進行檢測分析，確認引起這些養(yǎng)殖魚類暴發(fā)性死亡的疾病為彈狀病毒病，其病原為鱖魚彈狀病毒(Siniperca?chuatsi?rhabdovirus，SCRV)。?

彈狀病毒(Rhabdovirus)是一種單股不分節(jié)段的負鏈RNA病毒，病毒粒子大小為(100-430)nm×(45-100)nm，形態(tài)似棒狀或子彈狀。彈狀病毒種類較多，包括175種以上的成員，可感染脊椎動物、無脊椎動物及植物。魚類彈狀病毒因感染宿主廣、毒株種類多、毒力強，嚴重危害各種淡水和海水魚。迄今報道感染魚類的彈狀病毒已有二十多種，其中危害較大的有鯉春病毒血癥病毒(SVCV)。病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)、傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)、牙鲆彈狀病毒(HRV)和鱖魚彈狀病毒(SCRV)等。通過調查了解發(fā)現(xiàn)，自然感染鱖魚彈狀病毒的烏鱧、鱖魚、加州鱸魚死亡率高達90％。為了及早發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖魚類是否被SCRV感染，有必要建立一種快速、準確、靈敏的檢測方法。?

傳統(tǒng)病毒病的診斷需要進行病毒分離，細胞培養(yǎng)，電鏡觀察以及免疫檢測等方法，缺乏對病毒進行快速、準確、敏感的檢測方法。PCR方法具有操作簡單、特異、快速、敏感等優(yōu)點，正逐步應用于病原微生物的檢測與研究中。?

發(fā)明內容

本發(fā)明所要解決的技術問題是，克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種鱖魚彈狀病毒的逆轉錄-聚合酶鏈式反應檢測方法，能快速、高效地用于鱖魚彈狀病毒的檢測。?

鱖魚彈狀病毒的逆轉錄-聚合酶鏈式反應檢測試劑盒，所述試劑盒包括：?

(1)5×逆轉錄緩沖液100μL；?

(2)逆轉錄酶25μL；?

(3)隨機引物25μL；?

(4)2×聚合酶鏈式反應混合緩沖液1.0mL，包含以下成分：?

(5)檢測引物的設計合成：根據(jù)GenBank中發(fā)布的鱖魚彈狀病毒的基因序列，在其保守序列設計一對特異性檢測引物，上游引物P1：5’-ATAAGGGTAGTTGAGAAGAAG-3’，下游引物P2：5’-CTTCTTGTTGCTCTTCTTAAA-3’，濃度為10μM；?

(6)Taq酶?????????5U/μL；?

(7)滅菌的ddH₂O???1.0mL；?

(8)陽性對照液：提取鱖魚彈狀病毒總RNA，逆轉錄獲得cDNA，然后以cDNA為模板，以Pl、P2為引物，進行PCR擴增，將回收純化的擴增產物連接到pMD18-T載體，以陽性克隆的重組質粒作為陽性對照；?

(9)陰性對照液：以ddH₂O作為陰性對照。?

采用試劑盒檢測鱖魚彈狀病毒的方法為：?

(1)待測樣品RNA的提取：解剖待檢測的魚樣品，取肝、脾、腎等組織進行勻漿，采用傳統(tǒng)的Trizol法或者商業(yè)化的RNA提取試劑盒提取RNA，用ddH₂O溶解，即為試驗用RNA模板；?

(2)逆轉錄合成cDNA：取待測樣品的RNA模板7μL，加入PCR反應管中，再加入5×逆轉錄緩沖液2μL、逆轉錄酶0.5μL、隨機引物0.5μL，反應總體積10μL，充分混勻后，置于PCR儀上，37℃15min逆轉錄反應，85℃5sec滅活逆轉錄，得到cDNA產物；?

(3)PCR擴增：采用25μL的PCR反應體系，在0.2mL?PCR反應管內分別加入2×反應混合緩沖液12.5μL，上游引物P1、下游引物P2各0.5μL，5U/μL?Taq?DNA聚合酶0.5μL，cDNA模板3.0μL，用滅菌超純水加至總體積，同時分別用陽性對照液和陰性對照液作為模板，設置陽性和陰性對照組，混合均勻后離心數(shù)秒進行PCR反應，反應程序為：94℃預變性5分鐘；然后94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循環(huán)35次；72℃延伸10分鐘，最后4℃保存；?

(4)PCR擴增產物的檢測：PCR反應結束后，取10μL產物在1.5％瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠0.5μg/mL)上，使用TAE緩沖液進行電泳，在紫外透射儀下觀察PCR產物，檢查PCR產物的預期大小；?