[發明專利]鱖魚彈狀病毒的檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201410315460.3
• 申請日: 2014-07-02
• 公開（公告）號: CN104032038A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發明（設計）人: 雷燕;張會軍;劉婉;王惠儒;張文文
• 申請（專利權）人: 廣州金水動物保健品有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.鱖魚彈狀病毒的逆轉錄-聚合酶鏈式反應檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：?

(1)5×逆轉錄緩沖液100μL；?

(2)逆轉錄酶25μL；?

(3)隨機引物25μL；?

(4)2×聚合酶鏈式反應混合緩沖液1.0mL，包含以下成分：?

(5)檢測引物的設計合成：根據GenBank中發布的鱖魚彈狀病毒的基因序列，在其保守序列設計一對特異性檢測引物，上游引物P1：5’-ATAAGGGTAGTTGAGAAGAAG-3’，下游引物P2：5’-CTTCTTGTTGCTCTTCTTAAA-3’，濃度為10μM；?

(6)Taq酶?????????5U/μL；?

(7)滅菌的ddH₂O???1.0mL；?

(8)陽性對照液：提取鱖魚彈狀病毒總RNA，逆轉錄獲得cDNA，然后以cDNA為模板，以Pl、P2為引物，進行PCR擴增，將回收純化的擴增產物連接到pMD18-T載體，以陽性克隆的重組質粒作為陽性對照；?

(9)陰性對照液：以ddH₂O作為陰性對照。?

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，采用試劑盒檢測鱖魚彈狀病毒的方法為：?

(1)待測樣品RNA的提取：解剖待檢測的魚樣品，取肝、脾、腎等組織進行勻漿，采用傳統的Trizol法或者商業化的RNA提取試劑盒提取RNA，用ddH₂O溶解，即為試驗用RNA模板；?

(2)逆轉錄合成cDNA：取待測樣品的RNA模板7μL，加入PCR反應管中，再加入5×逆轉錄緩沖液2μL、逆轉錄酶0.5μL、隨機引物0.5μL，反應總體積10μL，充分混勻后，置于PCR儀上，37℃15min逆轉錄反應，85℃5sec滅活逆轉錄，得到cDNA產物；?

(3)PCR擴增：采用25μL的PCR反應體系，在0.2mL?PCR反應管內分別加入2×反應混合緩沖液12.5μL，上游引物P1、下游引物P2各0.5μL，5U/μL?Taq?DNA聚合酶0.5μL，cDNA模板3.0μL，用滅菌超純水加至總體積，同時分別用陽性對照液和陰性對照液作為模板，設置陽性和陰性對照組，混合均勻后離心數秒進行PCR反應，反應程序為：94℃預變性5分鐘；?然后94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循環35次；72℃延伸10分鐘，最后4℃保存；?

(4)PCR擴增產物的檢測：PCR反應結束后，取10μL產物在1.5％瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠0.5μg/mL)上，使用TAE緩沖液進行電泳，在紫外透射儀下觀察PCR產物，檢查PCR產物的預期大小；?

(5)結果與判定：在紫外燈下觀察并與標準分子量相對照，若檢測樣品在372bp處出現明亮的條帶，而陰性對照沒有目的條帶，則為鱖魚彈狀病毒陽性；若陽性對照可見目的條帶，而檢測樣品無目的條帶出現，則為陰性，沒有或不是所要檢測的目的鱖魚彈狀病毒。?