[發明專利]用于鑒定布魯氏菌自然感染或免疫接種家畜的方法

在審

• 申請號: 201410314620.2
• 申請日: 2014-07-03
• 公開（公告）號: CN104166000A
• 公開（公告）日: 2014-11-26
• 發明（設計）人: 崔步云;姜海;楊星雅;田國忠;趙鴻雁;樸東日
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及蛋白質組學，具體地說，涉及一種用于鑒定布魯氏菌自然感染或免疫接種家畜的方法。

背景技術

布魯氏菌(Brucella，簡稱布氏菌)是一種革蘭染色陰性的兼性細胞內寄生菌，是布魯氏菌病(Brucellosis，簡稱布病)的病原菌。布病是一種人獸共患病，在我國傳染病防治法中屬于乙類傳染病。國際上，布病被歸為B類傳染病，在世界范圍內都有流行，特別是2000年以后，布病疫情大幅度上升，給人民群眾帶來嚴重的健康損害和經濟損失。

目前，布魯氏菌診斷的金標準是細菌分離培養，但是，布魯氏菌培養難度大，周期長，且分離率低。最常用的血清學檢測方法為虎紅平板凝集試驗(RBPT)、試管凝集試驗(SAT)、補體結合試驗(CFT)等，另外，由布魯氏菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)包被的ELISA檢測方法也逐步用于布病的診斷。但以上方法均無法區別試管凝集陽性血清是由于疫苗免疫還是自然感染。隨著基因組學和蛋白質組學的發展，許多科研人員著眼于尋找布魯氏菌疫苗株與野毒株的差異蛋白，并且進行了大量研究，但是目前為止，并沒有找到一個能夠從本質上區別疫苗株與野毒株的理想方法。

人間布病的防控與動物布病的防控密不可分，而且研究數據顯示人間布病的流行趨勢與動物布病的流行趨勢相符。在我國，牛和羊是布病主要的傳染源，因此，控制牛和羊的布病疫情，有利于控制人間布病的流行，對減少國家和人民的經濟損失具有重大意義。家畜布病預防的主要措施之一是疫苗的免疫接種。但是，由于傳統的檢測方法無法區別家畜的自然感染和免疫接種，如果將布病病畜誤以為是免疫家畜，會保存傳染源，對人和健康家畜帶來極大威脅，反之，若將免疫家畜誤以為是布病疫畜而淘汰宰殺，會對國家及個人經濟帶來巨大損失。特別是牛作為一種布病常見傳染源，且其經濟價值較高，所以，在目前疫情極其嚴重時期，更加需要一種方法能夠區別出牛是自然感染還是免疫接種，并據此采取科學的處理措施，最大程度的避免不必要的經濟損失，同時鑒別染疫動物保護人及其他家畜的健康。

目前，我國最普遍應用于牛的疫苗是M5和S2，分別是羊種和豬種布魯氏菌的弱毒活疫苗株，而自然感染的病牛，主要是牛種布魯氏菌。隨著布魯氏菌全基因組測序技術的發展，已經有報道bp26基因存在于所有布魯氏菌種中，而且種間相當保守，而omp31基因存在于除牛種之外的所有布魯氏菌中，所以，將Bp26蛋白作為陽性對照蛋白，而Omp31蛋白作為種間差異標識蛋白，可有效地將牛種布魯氏菌與羊種和豬種等其他布魯氏菌種從血清學方法上區分開來，進而判斷SAT陽性的牛是自然感染還是免疫接種。

發明內容

本發明主要根據家畜免疫接種疫苗株與自然感染的布魯氏菌種的不同，通過區分布魯氏菌的種間差異，間接的將疫苗接種與自然感染的家畜區分開來。

為了實現本發明目的，本發明提供一種用于鑒定布魯氏菌自然感染或免疫接種家畜的方法，其是將Omp31蛋白或含His標簽的重組Omp31蛋白作為布魯氏菌種間差異標識蛋白，且以Bp26蛋白或含His標簽的重組Bp26蛋白作為陽性對照蛋白，對于布魯氏菌感染血清SAT呈陽性的家畜，Bp26蛋白或含His標簽的重組Bp26蛋白與不同種的布魯氏菌感染血清均發生反應，而Omp31蛋白或含His標簽的重組Omp31蛋白僅與除牛種布魯氏菌以外的其它種的布魯氏菌感染血清發生反應，進而判定SAT呈陽性的家畜為布魯氏菌自然感染或免疫接種。

其中，所述含His標簽的重組Omp31蛋白以及含His標簽的重組Bp26蛋白的制備方法為：

1)從NCBI上獲取bp26和omp31的基因序列(bp26基因的GenBank編號為AY166768.1，omp31基因的GenBank編號為AF366063.1)，分別設計引物，PCR擴增bp26基因和omp31基因；

2)分別對步驟1)的擴增產物進行酶切，然后將bp26基因片段與經過相同酶切的pET30a質粒連接，將omp31基因片段與經過相同酶切的pET32a質粒連接，分別將連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆；

3)將步驟2)中篩選到的陽性克隆分別接種到含相應抗生素的LB液體培養基中，加入誘導劑IPTG進行誘導，將誘導后的菌液離心，收集菌體，加入PBS液重懸菌體，超聲破碎后離心，所得沉淀用尿素溶解，離心后收集上清，用孔徑0.45μm的濾膜過濾，濾液過His標簽蛋白純化柱，即得含His標簽的重組蛋白。

用于PCR擴增bp26基因的引物包括：