[發明專利]用于鑒定布魯氏菌自然感染或免疫接種家畜的方法

在審

• 申請號: 201410314620.2
• 申請日: 2014-07-03
• 公開（公告）號: CN104166000A
• 公開（公告）日: 2014-11-26
• 發明（設計）人: 崔步云;姜海;楊星雅;田國忠;趙鴻雁;樸東日
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.一種用于鑒定布魯氏菌自然感染或免疫接種家畜的方法，其特征在于，其是將Omp31蛋白或含His標簽的重組Omp31蛋白作為布魯氏菌種間差異標識蛋白，且以Bp26蛋白或含His標簽的重組Bp26蛋白作為陽性對照蛋白，對于布魯氏菌感染血清SAT呈陽性的家畜，Bp26蛋白或含His標簽的重組Bp26蛋白與不同種的布魯氏菌感染血清均發生反應，而Omp31蛋白或含His標簽的重組Omp31蛋白僅與除牛種布魯氏菌以外的其它種的布魯氏菌感染血清發生反應，進而判定SAT呈陽性的家畜為布魯氏菌自然感染或免疫接種。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，利用蛋白免疫印跡法檢測蛋白與布魯氏菌感染血清中抗相應蛋白的特異性抗體之間的反應。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述含His標簽的重組Omp31蛋白以及含His標簽的重組Bp26蛋白的制備方法為：

1)從NCBI上獲取bp26和omp31的基因序列，分別設計引物，PCR擴增bp26基因和omp31基因；

2)分別對步驟1)的擴增產物進行酶切，然后將bp26基因片段與經過相同酶切的pET30a質粒連接，將omp31基因片段與經過相同酶切的pET32a質粒連接，分別將連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆；

3)將步驟2)中篩選到的陽性克隆分別接種到含相應抗生素的LB液體培養基中，加入誘導劑IPTG進行誘導，將誘導后的菌液離心，收集菌體，加入PBS液重懸菌體，超聲破碎后離心，所得沉淀用尿素溶解，離心后收集上清，用孔徑0.45μm的濾膜過濾，濾液過His標簽蛋白純化柱，即得含His標簽的重組蛋白。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，用于PCR擴增bp26基因的引物包括：

上游引物：5’-CCGGAATTCATGAACACTCGTGCTAGCAA-3’和

下游引物：5’-CCGCTCGAGTTACTTGATTTCAAAAACGACAT-3’。

5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，用于PCR擴增omp31基因的引物包括：

上游引物：5’-CCGGAATTCATGAAATCCGTAATTTTGGC-3’和

下游引物：5’-CCGGAATTCATGAAATCCGTAATTTTGGC-3’。

6.根據權利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于，所述家畜包括但不限于牛。

7.用于鑒定布魯氏菌自然感染或免疫接種家畜的試劑盒，其特征在于，以Omp31蛋白或含His標簽的重組Omp31蛋白，以及Bp26蛋白或含His標簽的重組Bp26蛋白作為包被抗原。