[發(fā)明專利]UPF0538蛋白多克隆抗體的獲取方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410311523.8
• 申請(qǐng)日: 2014-07-02
• 公開（公告）號(hào): CN104031931A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡江江;戚武林;高亞軍;張世馥;趙輔昆
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C07K16/18;C07K16/06
• 代理公司: 北京科億知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為UPF0538蛋白多克隆抗體的獲取方法。

背景技術(shù)

金屬螯合親和層析是建立在蛋白質(zhì)表面的氨基酸與固定化金屬離子的親和力的不同來進(jìn)行蛋白質(zhì)分離的一項(xiàng)技術(shù)。金屬離子能夠與電子供體，如氮、氧、硫等原子以配位鍵結(jié)合，金屬離子上剩余的空軌道是電子供體的配位點(diǎn)，當(dāng)它在水溶液中時(shí)，會(huì)被水分子或者陰離子占據(jù)。然而，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)表面的氨基酸殘基與金屬離子的結(jié)合能力較強(qiáng)時(shí)，氨基酸殘基的供電原子就會(huì)取代原先結(jié)合的水分子或者陰離子，從而與金屬離子結(jié)合形成復(fù)合物。鎳柱親和層析的原理是利用蛋白質(zhì)表面的組氨酸能與金屬離子Ni²⁺發(fā)生特殊的相互作用，能夠吸附富含組氨酸的蛋白質(zhì)，從而達(dá)到分離純化的目的。

小鼠UPF0538基因位于1號(hào)染色體上，其cDNA為381nt，UPF0538蛋白含有126個(gè)氨基酸，分子量約為14.6?kDa。在不同天數(shù)（9.5d-17.5d）小鼠胎肝的差異蛋白質(zhì)組中，發(fā)現(xiàn)了UPF0538蛋白。由此推測，UPF0538蛋白可能與小鼠紅細(xì)胞生成有關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種效價(jià)高，特異性好的UPF0538蛋白多克隆抗體的獲取方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所解決的技術(shù)問題采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

UPF0538蛋白多克隆抗體的獲取方法是利用設(shè)計(jì)的含有酶切位點(diǎn)引物將UPF0538基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過酶切構(gòu)建原核表達(dá)載體，從而獲得原核表達(dá)載體pET-28a(+)-UPF0538；再將原核表達(dá)載體pET-28a(+)-UPF0538轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli?BL21(DE3)并用IPTG進(jìn)行目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)，獲得UPF0538蛋白；將UPF0538蛋白純化至85%以上；將純化后的UPF0538蛋白通過脫鹽、濃縮用于免疫兔，在最后一次免疫的一周后頸動(dòng)脈取血，收集血清；血清純化后，獲得目的UPF0538多克隆抗體。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步方案，所述酶切位點(diǎn)引物包括上游引物：5＇-GAGGAATTCATGGCTGCGGAGGAAG-3＇和下游引物：5＇-ACCCTCGAGTCACCAGGACGAGATG-3＇，上游引物序列中的GAATTC片段為EcoR?I酶切位點(diǎn)；下游引物序列中的CTCGAG片段為Xho?I酶切位點(diǎn)。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步方案，所述免疫兔為新西蘭大白兔上，首次免疫后，每隔7天加強(qiáng)免疫1次，抗原量為首次免疫用量的一半，共加強(qiáng)免疫3次，均采用頸部皮下多點(diǎn)注射，首次免疫用弗氏完全佐劑乳化，加強(qiáng)免疫用弗氏不完全佐劑乳化，最后一次免疫7?d后頸動(dòng)脈取血，血清純化后，獲得目的UPF0538多克隆抗體。

有益效果

本發(fā)明通過設(shè)計(jì)的特異性引物，通過RT-PCR技術(shù)對(duì)UPF0538基因進(jìn)行克隆測序，再進(jìn)行原核表達(dá)載體pET-28a(+)-UPF0538的構(gòu)建，然后進(jìn)行了UPF0538原核表達(dá)；最后將UPF0538蛋白純化到85%以上后進(jìn)行UPF0538多克隆抗體的制備與純化。本發(fā)明獲得的產(chǎn)品效價(jià)高，特異性好，可以滿足UPF0538蛋白的相關(guān)測定，彌補(bǔ)了UPF0538的多克隆抗體的研究空白，為研究UPF0538蛋白提供材料。

附圖說明

圖1為為UPF0538PCR的擴(kuò)增結(jié)果示意圖：圖中，1:DL2000?marker，2：PCR產(chǎn)物；

圖2為重組質(zhì)粒酶切鑒定圖：圖中，M：DL15000?marker，1：pET-28a(+)質(zhì)粒，2：pET-28a(+)-UPF0538重組質(zhì)粒，3：?EcoRⅠ單酶切重組質(zhì)粒，4：EcoRⅠ與Xho?I雙酶切重組質(zhì)粒；

圖3為UPF0538蛋白的表達(dá)：圖中，M:蛋白marker，1：BL21/pET-28a(+)?未誘導(dǎo)，2：BL21/pET-28a(+)?誘導(dǎo)，3：BL21/pET-28a(+)-UPF0538未誘導(dǎo)，4：BL21/pET-28a(+)-UPF0538誘導(dǎo)，5：BL21/pET-28a(+)-UPF0538誘導(dǎo)后超聲上清；

圖4為UPF0538蛋白的純化結(jié)果示意圖；

圖5為純化后的UPF0538抗體的效價(jià)示意圖；

圖6為PBDC1多克隆抗體的Western?blot檢測電鏡圖。

具體實(shí)施方式