[發(fā)明專利]一種快速構(gòu)建血漿DNA測(cè)序文庫(kù)的方法和試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410311003.7
• 申請(qǐng)日: 2014-06-24
• 公開（公告）號(hào): CN105296602B
• 公開（公告）日: 2020-07-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳迪;李亞麗;李天成;石燕濱;張江花;吳凱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京貝瑞和康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6806
• 分類號(hào): C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06;C40B40/06
• 代理公司: 北京市金杜律師事務(wù)所 11256
• 代理人: 孟凡宏;謝燕軍

本發(fā)明提供了用于構(gòu)建血漿DNA測(cè)序文庫(kù)的方法，包括以下步驟：1)抽提血漿DNA；2)任選將血漿DNA進(jìn)行末端補(bǔ)平，獲得末端補(bǔ)平后的血漿DNA；3)將任選末端補(bǔ)平后的血漿DNA進(jìn)行3’懸A，獲得3’懸A后的血漿DNA；4)將3’懸A后的血漿DNA與測(cè)序接頭連接，獲得連接產(chǎn)物；5)對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行純化，獲得純化產(chǎn)物。本發(fā)明也提供用于構(gòu)建血漿DNA測(cè)序文庫(kù)的試劑盒。本發(fā)明大大簡(jiǎn)化了血漿DNA測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建流程，除去了由于PCR擴(kuò)增造成的環(huán)境以及樣本間的污染，降低了血漿DNA文庫(kù)構(gòu)建對(duì)環(huán)境的要求，同時(shí)也除去了由于PCR過(guò)程造成的基因組覆蓋的不均一性，使得血漿樣本文庫(kù)構(gòu)建更加低成本、高效、快速，血漿DNA測(cè)序結(jié)果更加真實(shí)、有效。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于構(gòu)建血漿DNA測(cè)序文庫(kù)的方法和試劑盒，更具體地，本發(fā)明涉及用于構(gòu)建高通量測(cè)序的血漿DNA文庫(kù)構(gòu)建的方法和試劑盒。

背景技術(shù)

隨著科技的進(jìn)步，傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序已經(jīng)不能完全滿足研究的需要，對(duì)基因組測(cè)序，需要費(fèi)用更低、通量更高、速度更快的測(cè)序技術(shù)，高通量測(cè)序(也稱第二代測(cè)序)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。高通量測(cè)序技術(shù)的核心思想是邊合成邊測(cè)序，即通過(guò)捕捉新合成的末端的標(biāo)記來(lái)確定DNA的序列，現(xiàn)有的技術(shù)平臺(tái)主要包括Roche/454FLX、Illumina/Hiseq、Miseq、NextSeq和Life Technologies/SOLID system、PGM、Proton等。到目前為止，HiSeq2000每個(gè)run可以達(dá)到6個(gè)人基因組30X覆蓋的測(cè)序通量，約600G/run數(shù)據(jù)，在測(cè)序時(shí)間上Hiseq2500可以達(dá)到平均每8分鐘讀取一個(gè)堿基的速度。而且隨著第二代測(cè)序技術(shù)的成熟，將其應(yīng)用于臨床的研究迅猛發(fā)展。

血漿DNA又稱循環(huán)DNA，是血液中的細(xì)胞外DNA，長(zhǎng)約幾十到幾百核苷酸，可以以DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形式存在，也可以是游離的DNA片段。正常情況下，血漿DNA來(lái)源于少量衰老死亡細(xì)胞的DNA釋放。健康狀態(tài)下，循環(huán)DNA的生成與清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，維持在較恒定的低水平。循環(huán)DNA能反映人體內(nèi)細(xì)胞新陳代謝的狀況，是健康評(píng)判的一個(gè)重要指標(biāo)。外周血循環(huán)DNA量和質(zhì)的改變與多種疾病(包括腫瘤、復(fù)合性嚴(yán)重外傷、器官移植、妊娠相關(guān)疾病、感染性疾病、器官功能衰竭等)關(guān)系密切，作為一種無(wú)創(chuàng)性檢測(cè)指標(biāo)，有望成為某些疾病早期診斷、病情監(jiān)測(cè)、療效及預(yù)后評(píng)估的一種重要的分子標(biāo)志物。

自從母體血液中的胚胎DNA被發(fā)現(xiàn)之后，無(wú)創(chuàng)傷地直接診斷和檢測(cè)胚胎染色體異常性成了一個(gè)重大的研究課題。2008年，盧煜明教授及其團(tuán)隊(duì)率先使用高通量測(cè)序檢測(cè)孕婦血漿DNA，統(tǒng)計(jì)染色體比例關(guān)系，血漿中微量的胚胎DNA的染色體數(shù)目的變化能被檢測(cè)出來(lái)(Chiu，Chan et al.2008)。隨著檢測(cè)技術(shù)的逐漸完善成熟，各國(guó)都在致力于將該實(shí)驗(yàn)室技術(shù)轉(zhuǎn)為臨床應(yīng)用。另有研究發(fā)現(xiàn)，癌癥病人的癌細(xì)胞凋亡產(chǎn)物(包括斷裂游離的癌細(xì)胞DNA)會(huì)釋放到的血液中，隨血液循環(huán)系統(tǒng)運(yùn)送到全身，血漿DNA中攜帶有癌細(xì)胞基因組的全部遺傳信息(Schwarzenbach，Hoon et al.2011)。近期，盧煜明教授發(fā)現(xiàn)通過(guò)對(duì)癌癥病人血漿DNA進(jìn)行高通量測(cè)序，以統(tǒng)計(jì)重復(fù)區(qū)甲基化狀況，可以有效區(qū)分癌癥患者和健康人群(Chan，Jiang et al.2013)。

測(cè)序效率的提升和多樣品混合測(cè)序的普及對(duì)樣品的制備效率提出了更高的要求，特別是大量臨床樣品制備；而現(xiàn)有的臨床血漿樣品制備方法的發(fā)展一直趕不上測(cè)序能力的提高。因此，第二代高通量測(cè)序臨床血漿DNA樣品的制備效率和成本，成為高通量測(cè)序能否得以普及的關(guān)鍵。