[發(fā)明專利]一種快速構建血漿DNA測序文庫的方法和試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410311003.7
• 申請日: 2014-06-24
• 公開（公告）號: CN105296602B
• 公開（公告）日: 2020-07-17
• 發(fā)明（設計）人: 陳迪;李亞麗;李天成;石燕濱;張江花;吳凱
• 申請（專利權）人: 北京貝瑞和康醫(yī)學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06;C40B40/06
• 代理公司: 北京市金杜律師事務所 11256
• 代理人: 孟凡宏;謝燕軍

本發(fā)明提供了用于構建血漿DNA測序文庫的方法，包括以下步驟：1)抽提血漿DNA；2)任選將血漿DNA進行末端補平，獲得末端補平后的血漿DNA；3)將任選末端補平后的血漿DNA進行3’懸A，獲得3’懸A后的血漿DNA；4)將3’懸A后的血漿DNA與測序接頭連接，獲得連接產(chǎn)物；5)對連接產(chǎn)物進行純化，獲得純化產(chǎn)物。本發(fā)明也提供用于構建血漿DNA測序文庫的試劑盒。本發(fā)明大大簡化了血漿DNA測序文庫的構建流程，除去了由于PCR擴增造成的環(huán)境以及樣本間的污染，降低了血漿DNA文庫構建對環(huán)境的要求，同時也除去了由于PCR過程造成的基因組覆蓋的不均一性，使得血漿樣本文庫構建更加低成本、高效、快速，血漿DNA測序結果更加真實、有效。

技術領域

本發(fā)明涉及用于構建血漿DNA測序文庫的方法和試劑盒，更具體地，本發(fā)明涉及用于構建高通量測序的血漿DNA文庫構建的方法和試劑盒。

背景技術

隨著科技的進步，傳統(tǒng)的Sanger測序已經(jīng)不能完全滿足研究的需要，對基因組測序，需要費用更低、通量更高、速度更快的測序技術，高通量測序(也稱第二代測序)技術應運而生。高通量測序技術的核心思想是邊合成邊測序，即通過捕捉新合成的末端的標記來確定DNA的序列，現(xiàn)有的技術平臺主要包括Roche/454FLX、Illumina/Hiseq、Miseq、NextSeq和Life Technologies/SOLID system、PGM、Proton等。到目前為止，HiSeq2000每個run可以達到6個人基因組30X覆蓋的測序通量，約600G/run數(shù)據(jù)，在測序時間上Hiseq2500可以達到平均每8分鐘讀取一個堿基的速度。而且隨著第二代測序技術的成熟，將其應用于臨床的研究迅猛發(fā)展。

血漿DNA又稱循環(huán)DNA，是血液中的細胞外DNA，長約幾十到幾百核苷酸，可以以DNA-蛋白質復合物的形式存在，也可以是游離的DNA片段。正常情況下，血漿DNA來源于少量衰老死亡細胞的DNA釋放。健康狀態(tài)下，循環(huán)DNA的生成與清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，維持在較恒定的低水平。循環(huán)DNA能反映人體內細胞新陳代謝的狀況，是健康評判的一個重要指標。外周血循環(huán)DNA量和質的改變與多種疾病(包括腫瘤、復合性嚴重外傷、器官移植、妊娠相關疾病、感染性疾病、器官功能衰竭等)關系密切，作為一種無創(chuàng)性檢測指標，有望成為某些疾病早期診斷、病情監(jiān)測、療效及預后評估的一種重要的分子標志物。

自從母體血液中的胚胎DNA被發(fā)現(xiàn)之后，無創(chuàng)傷地直接診斷和檢測胚胎染色體異常性成了一個重大的研究課題。2008年，盧煜明教授及其團隊率先使用高通量測序檢測孕婦血漿DNA，統(tǒng)計染色體比例關系，血漿中微量的胚胎DNA的染色體數(shù)目的變化能被檢測出來(Chiu，Chan et al.2008)。隨著檢測技術的逐漸完善成熟，各國都在致力于將該實驗室技術轉為臨床應用。另有研究發(fā)現(xiàn)，癌癥病人的癌細胞凋亡產(chǎn)物(包括斷裂游離的癌細胞DNA)會釋放到的血液中，隨血液循環(huán)系統(tǒng)運送到全身，血漿DNA中攜帶有癌細胞基因組的全部遺傳信息(Schwarzenbach，Hoon et al.2011)。近期，盧煜明教授發(fā)現(xiàn)通過對癌癥病人血漿DNA進行高通量測序，以統(tǒng)計重復區(qū)甲基化狀況，可以有效區(qū)分癌癥患者和健康人群(Chan，Jiang et al.2013)。

測序效率的提升和多樣品混合測序的普及對樣品的制備效率提出了更高的要求，特別是大量臨床樣品制備；而現(xiàn)有的臨床血漿樣品制備方法的發(fā)展一直趕不上測序能力的提高。因此，第二代高通量測序臨床血漿DNA樣品的制備效率和成本，成為高通量測序能否得以普及的關鍵。