[發(fā)明專利]一株產(chǎn)聚3-羥基丁酸酯的重組大腸桿菌及構(gòu)建方法及用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410310295.2
• 申請(qǐng)日: 2014-09-19
• 公開（公告）號(hào): CN104195158A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳濤;林振泉;張妍;劉巧潔;王智文;趙學(xué)明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12N1/21;C12P7/62;C12R1/19
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 陸藝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)與應(yīng)用領(lǐng)域，具體地涉及一株產(chǎn)聚3-羥基丁酸酯的重組大腸桿菌及構(gòu)建方法及用途。

背景技術(shù)

聚羥基脂肪酸酯(PHA)是一類廣泛存在于微生物細(xì)胞內(nèi)的高分子生物聚酯,作為碳源和能源的儲(chǔ)備,具有完全的生物相容性及生物可降解性，具有部分替代石油化工產(chǎn)品的潛力。而聚-3-羥基丁酸酯(PHB)是其中一種得到最普遍研究的一類短鏈單體聚合物，在很多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。PHB具有不溶于水，防潮，光學(xué)純度高以及良好的氧滲透性等優(yōu)點(diǎn)。

大多數(shù)天然的PHB生產(chǎn)菌(包括Ralstonia?eutropha,Pseudomonas?putida,Aeromonas?hydrophila等)中，PHB的合成由三個(gè)連續(xù)的酶促反應(yīng)步驟組成，首先由β-酮基硫解酶PhaA催化2個(gè)乙酰輔酶A縮合形成乙酰乙酰輔酶A，進(jìn)而在NADPH依賴型乙酰乙酰輔酶A還原酶PhaB的催化下還原為(R)-3-羥基丁酰輔酶A，最后由PHA合酶PhaC催化其聚合成PHB。大腸桿菌作為工業(yè)生物技術(shù)研究最廣泛的微生物，本身并不具備PHB的合成途徑。但當(dāng)引入異源PHB合成途徑后，重組大腸桿菌由于生長快速，可利用多種廉價(jià)碳源和具有完全清晰的遺傳操作體系，已作為一種良好的PHB生產(chǎn)菌被得到廣泛的應(yīng)用。且大腸桿菌不具備PHA降解酶，聚酯的積累水平較高，易破壁，有利于產(chǎn)品的分離提純。

目前，利用基因工程方法對(duì)產(chǎn)PHB大腸桿菌的改造策略主要包括增加PHB合成前體乙酰輔酶A和輔因子NADPH在胞內(nèi)的富集度以及優(yōu)化PHB的合成途徑。針對(duì)通過增加乙酰輔酶A的胞內(nèi)富集度來提高大腸桿菌PHB生產(chǎn)力的基因工程改造主要集中于改造糖酵解途徑及減少乙酰輔酶A衍生的副產(chǎn)物以及競爭途徑的表達(dá)。

大腸桿菌作為一種重要的模式菌株，對(duì)其生理生化特性及遺傳背景已經(jīng)有了比較深入的了解，相關(guān)的分子生物學(xué)方法和基因操作技術(shù)都比較成熟，有利于通過代謝工程及合成生物學(xué)的合理設(shè)計(jì)來改進(jìn)菌種。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株產(chǎn)聚-3-羥基丁酸酯的重組大腸桿菌。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供的一株產(chǎn)聚-3-羥基丁酸酯的重組大腸桿菌構(gòu)建方法。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一株產(chǎn)聚-3-羥基丁酸酯的重組大腸桿菌的用途。

一株產(chǎn)聚3-羥基丁酸酯的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)設(shè)計(jì)以SEQ?ID?NO.1所示的代號(hào)為RBS5的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，將Escherichia?coli?JM109的sdaA基因的啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列置換為以SEQ?ID?NO.33所示的組成型啟動(dòng)子trc及RBS5，構(gòu)建工程菌株SD01；

(2)設(shè)計(jì)以SEQ?ID?NO.2所示的核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS1、以SEQ?ID?NO.3所示的核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS2、以SEQ?ID?NO.4所示的核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS3和以SEQ?ID?NO.5所示的核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS4；

(3)將RBS1和SEQ?ID?NO.36所示的基因pgk編碼序列連接成片段1、將RBS2和SEQ?ID?NO.37所示的基因serA編碼序列連接成片段2、將RBS3和SEQ?ID?NO.38所示的基因serB編碼序列連接成片段3、將RBS4和SEQ?ID?NO.39所示的基因serC編碼序列連接成片段4；

(4)將片段1、片段2、片段3和片段4通過重疊-延伸PCR融合為操縱子PSer，與SEQ?ID?NO.32所示的含啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列Trc-162一同整合到步驟(1)獲得的工程菌株SD01的基因組serC基因-58bp位點(diǎn)，得到工程菌株SD02；

(5)在菌株SD02的編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合體aceEF操縱子基因上游48bp插入SEQ?ID?NO.32所示序列，構(gòu)建工程菌株SD06；

(6)將含有PHB合成途徑基因的質(zhì)粒pBHR68導(dǎo)入SD06，得到基因型為E.coli?JM109,Ptrc-RBS5-sdaA,Trc-162-RBS1-pgk-RBS2-serA-RBS3-serB-RBS4-serC,Trc-162-aceEF,pBHR68,amp^r，簡稱為含pBHR68E.coli?SD06的產(chǎn)聚3-羥基丁酸酯的重組大腸桿菌。

上述方法構(gòu)建的一株產(chǎn)聚3-羥基丁酸酯的重組大腸桿菌。