[發明專利]miRNA169h基因預報水稻白葉枯病的方法

有效

• 申請號: 201410309783.1
• 申請日: 2014-06-30
• 公開（公告）號: CN104141008A
• 公開（公告）日: 2014-11-12
• 發明（設計）人: 張靜;章偉雄;高利芬;陳利紅;李利利;周俊飛;張繼;方治偉;盧龍;李甜甜
• 申請（專利權）人: 江漢大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京三高永信知識產權代理有限責任公司 11138
• 代理人: 徐立

1.miRNA169h基因預報水稻白葉枯病的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

選取9311/Xa23水稻品種作為待測水稻和對照水稻；

栽培所述待測水稻和所述對照水稻；

分別分離所述待測水稻和所述對照水稻中的總miRNA基因；

分別檢測所述待測水稻和所述對照水稻中的所述總miRNA基因中的miRNA169h基因的表達量，所述miRNA169h基因的序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示；

根據所述待測水稻和所述對照水稻中的miRNA169h基因的表達量，判定實驗是否成功，若成功，則進一步判斷所述待測植株是否感染白葉枯病。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述栽培所述待測水稻和所述對照水稻時，所述對照水稻在栽培時采用保護性栽培措施并防治白葉枯病，除所述保護性栽培措施和防治白葉枯病外，所述對照水稻與所述待測水稻的栽培條件保持一致。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述保護性栽培措施包括土壤隔離、水源隔離和空間隔離。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在上午8：55～9：05利用所述待測水稻和所述對照水稻的相同葉片的相同部位進行所述總miRNA基因的分離。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，采用實時定量PCR方法，檢測所述miRNA169h基因在所述待測水稻和所述對照水稻中的表達量。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述實時定量PCR方法的前處理步驟包括：

利用分光光度計測定并獲得分離的所述總miRNA基因的濃度；

向所述總miRNA基因中加入外源參考miRNA基因，得到第一混合液，所述外源參考miRNA基因的加入量為所述總miRNA基因質量的0.05％，所述外源參考miRNA基因的序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示；

分別將所述總miRNA基因和所述外源參考miRNA基因的5’端與3’端連接，得到環化的所述總miRNA基因和環化的所述外源參考miRNA基因的混合液；

將所述環化的總miRNA基因和所述環化的外源參考miRNA基因的混合液進行逆轉錄，得到的逆轉錄產物用于進行所述實時定量PCR檢測。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述采用實時定量PCR方法，檢測所述miRNA169h基因在所述待測水稻和所述對照水稻中的表達量，包括：

將2μl所述逆轉錄產物、3μl濃度為1μM的引物、10μl定量PCR混合物和0.4μl50倍的ROX熒光校正染料混合均勻，得到第二混合液，將所述第二混合液在實時定量PCR儀中進行反應，所述反應程序為：50℃2分鐘；95℃10分鐘；95℃45秒，56℃45秒，66℃30秒，67℃30秒，共45個循環，其中，66℃30秒和67℃30秒在每循環一次后分別增加0.1℃和0.2℃，在每一次循環的最后一步收集熒光信號，所述熒光信號的強弱用于衡量所述表達量的多少；

所述引物包括：序列如序列表中SEQ?ID?NO:3所示的miRNA169h基因正向引物、序列如序列表中SEQ?ID?NO:4所示的miRNA169h基因反向引物、序列如序列表中SEQ?ID?NO:5所示的外源參考miRNA基因正向引物、以及序列如序列表中SEQ?ID?NO:6所示的外源參考miRNA基因反向引物。

8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，將所述環化的總miRNA基因和所述環化的外源參考miRNA基因的混合液進行逆轉錄的步驟包括：

取所述環化的總miRNA基因和環化的外源參考miRNA基因的混合液2μl、5μl濃度為1μM的逆轉錄引物、2μl濃度為10mM的dNTP、5μl濃度為100mM的DTT和20U的逆轉錄酶，用水補足50μl混勻后，得到第四混合液，將所述第四混合液于42℃保溫2小時，75℃保溫15分鐘，使酶失活，得到所述逆轉錄產物；所述逆轉錄引物包括miRNA169h基因的逆轉錄引物和外源參考miRNA基因的逆轉錄引物，所述miRNA169h基因的逆轉錄引物序列如序列表中SEQ?ID?NO:7所示，所述外源參考miRNA基因的逆轉錄引物序列如序列表中SEQ?ID?NO:8所示。