[發明專利]miRNA169h基因預報水稻白葉枯病的方法

有效

• 申請號: 201410309783.1
• 申請日: 2014-06-30
• 公開（公告）號: CN104141008A
• 公開（公告）日: 2014-11-12
• 發明（設計）人: 張靜;章偉雄;高利芬;陳利紅;李利利;周俊飛;張繼;方治偉;盧龍;李甜甜
• 申請（專利權）人: 江漢大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京三高永信知識產權代理有限責任公司 11138
• 代理人: 徐立

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及miRNA169h基因預報水稻白葉枯病的方法。

背景技術

水稻是我國主要糧食作物，白葉枯病是水稻兩大主要病害之一，屬世界性病害，亞洲稻區發生尤重。白葉枯病發病率高、傳染快，發病稻田減產20-30％，甚至50％。與大部分病害一樣，白葉枯病發病早期防治效果較佳。發病中后期，病菌已大量繁殖，已對水稻造成了傷害，防治效果較差。由此可見，早期預報是水稻白葉枯病預防的關鍵所在。

傳統水稻白葉枯病預報主要依據氣候、天氣、品種抗性、氮肥施用情況、以及病害歷史等進行推測，也可依據田間水稻白葉枯病癥狀表現，對后期病情發展進行預報。

在實現本發明的過程中，發明人發現現有技術至少存在以下問題：

根據天氣、氣候、品種抗性、栽培現狀和歷史等進行的預報結果是很模糊的，可說明在一定區域與時間范圍內病害發生的概率，但不能預報病害發生的具體時間與地點，預報結果的可應用性較差。例如，高溫高濕常作為水稻白葉枯病的流行預報的氣候條件，但不能確定高溫高濕下病害是否一定出現、在那塊田出現、在那天出現。由于以上的不確定性，農民不能決定是否開始防治白葉枯、對哪塊田進行防治、以及何時防治。同時，病癥出現表明白葉枯病已進入中后期，病菌已大量繁殖，白葉枯病流行已難以避免，使得利用病癥調查進行預報的工作也無太大實際意義。

發明內容

為了解決現有技術中水稻白葉枯病預報不及時、不準確的缺點，本發明實施例提供了一種miRNA169h基因預報水稻白葉枯病的方法。所述技術方案如下：

選取9311/Xa23水稻品種作為待測水稻和對照水稻；

栽培所述待測水稻和所述對照水稻；

分別分離所述待測水稻和所述對照水稻中的總miRNA基因；

分別檢測所述待測水稻和所述對照水稻中的所述總miRNA基因中的miRNA169h基因的表達量，所述miRNA169h基因的序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示；

根據所述待測水稻和所述對照水稻中的miRNA169h基因的表達量，判定實驗是否成功，若成功，則進一步判定所述待測植株是否感染白葉枯病。

具體地，所述栽培所述待測水稻和所述對照水稻時，所述對照水稻在栽培時采用保護性栽培措施并防治白葉枯病，除所述保護性栽培措施和防治白葉枯病外，所述對照水稻與所述待測水稻的栽培條件保持一致。

進一步地，所述保護性栽培措施包括對土壤隔離、水源隔離和空間隔離。

具體地，在上午8：55～9：05利用所述待測水稻和所述對照水稻的相同葉片的相同部位進行所述總miRNA基因的分離。

具體地，采用實時定量PCR方法，檢測所述miRNA169h基因在所述待測水稻和所述對照水稻中的表達量。

進一步地，所述實時定量PCR方法的前處理步驟包括：

利用分光光度計測定并獲得分離的所述總miRNA基因的濃度；

向所述總miRNA基因中加入外源參考miRNA基因，得到第一混合液，所述外源參考miRNA基因的加入量為所述總miRNA基因質量的0.05％，所述外源參考miRNA基因的序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示；

將所述總miRNA基因和所述外源參考miRNA基因的5’端與3’端連接，得到環化的所述總miRNA基因和環化的所述外源參考miRNA基因的混合液；

將所述環化的總miRNA基因和所述環化的外源參考miRNA基因的混合液進行逆轉錄，得到的逆轉錄產物用于進行所述實時定量PCR檢測。

進一步地，所述采用實時定量PCR方法，檢測所述miRNA169h基因在所述待測水稻和所述對照水稻中的表達量，包括：

將2μl所述逆轉錄產物、3μl濃度為1μM的引物、10μl定量PCR混合物和0.4μl50倍的ROX熒光校正染料混合均勻，得到第二混合液，將所述第二混合液在實時定量PCR儀中進行反應，所述反應程序為：50℃2分鐘；95℃10分鐘；95℃45秒，56℃45秒，66℃30秒，67℃30秒，共45個循環，其中，66℃30秒和67℃30秒這兩步在每循環一次后分別增加0.1℃和0.2℃，在每一次循環的最后一步收集熒光信號，所述熒光信號的強弱用于衡量所述表達量的多少；