[發明專利]一種蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定細菌胞外蛋白酶種類上的應用

有效

• 申請號: 201410309658.0
• 申請日: 2014-07-01
• 公開（公告）號: CN104122317B
• 公開（公告）日: 2017-03-29
• 發明（設計）人: 何海倫;劉丹;武翠玲;楊興昊;吳日幫;黃嘉封;黃雅雯
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所43114
• 代理人: 袁靖

1.一種蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應用方法，其特征在于，包括以下步驟：

a.制備不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酰胺凝膠；

b.蛋白酶樣品與不含β-巰基乙醇的加樣緩沖液混勻后加樣，且加樣時樣品不在沸水浴中加熱；

c.電泳；

d.洗膠；

e.將膠放入含有不同蛋白酶抑制劑的底物溶液中浸泡；

f.反應顯色。

2.根據權利要求1所述的蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應用方法，其特征在于，

步驟a制備不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酰胺凝膠的過程如下：配制質量濃度為12.5％的分離膠：30％w/v凝膠貯備液1.6ml，pH8.8的1.5mol/L?Tris-HCl1.0ml，蒸餾水1.4ml，10％w/v過硫酸銨25μl，TEMED2.5μl；混勻后立即將分離膠注入準備好的玻璃板間隙中，用滴管輕輕在其頂層加入1ml蒸餾水，以阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用；聚合完成之后，倒掉覆蓋液體；配制5％w/v的上層濃縮膠：30％w/v凝膠貯備液0.15ml，pH6.8的0.5mol/L?Tris-HCl0.35ml，蒸餾水0.5ml，10％w/v過硫酸銨20μl，TEMED2.0μl；插入梳子，避免混入氣泡，放置室溫下。

3.根據權利要求1所述的蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應用方法，其特征在于，

步驟b中使用的不含β-巰基乙醇的加樣緩沖液配方為：60mM?Tris-HCl?pH6.8、SDS2％w/v、溴酚藍0.1％w/v、甘油25％v/v組成，加樣時樣品和加樣緩沖液的體積比為4：1。

4.根據權利要求1所述的蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應用方法，其特征在于，

步驟c中電泳緩沖液為pH8.8的Tris-甘氨酸緩沖液；電泳在冰浴中進行；采用垂直板式不連續系統電泳方法，5mA穩流進樣后，10mA穩流分離樣品直至溴酚藍指示劑到達膠的最前沿。

5.根據權利要求1所述的蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應用方法，其特征在于，

步驟d中電泳結束后，用預冷的2.5％Triton?X-100v/v將膠洗三次，每次15min；然后用預冷的蒸餾水漂洗數次去除殘留的Triton?X-100。

6.根據權利要求1所述的蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應用方法，其特征在于，

步驟e中將膠浸泡在用Tris-HCl緩沖液配制的含有5mM蛋白酶抑制劑和質量濃度為0.1-2％底物的溶液中，30-40℃溫浴1-3h。

7.根據權利要求6所述的蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應用方法，其特征在于，

將膠浸泡在用pH8.0的Tris-HCl緩沖液配制的含有5mM蛋白酶抑制劑和質量濃度為0.1％底物的溶液中，37℃溫浴1h后用蒸餾水將膠上殘留的底物沖洗干凈。

8.根據權利要求1或6或7所述的蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應用方法，其特征在于，蛋白酶抑制劑包括苯甲基磺酰氟，1,10-鄰菲啰啉或EDTA。

9.根據權利要求1所述的蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應用方法，其特征在于，

步驟f的具體過程為：用0.1％w/v的考馬斯亮藍R-250染色液染色3h，然后用脫色液脫色直至透明條帶清晰，其中染色液配方為：1g考馬斯亮藍R-250，350ml乙醇，100ml乙酸，加水至1000ml；脫色液配方為：250ml乙醇,100ml乙酸,加水至1000ml。

10.根據權利要求1所述的蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應用方法，其特征在于，蛋白酶樣品來源于將細菌菌株接種于發酵培養基，在相應培養條件下震蕩培養3～4天，4℃,13000rpm離心10min后得到的上清液，或是其他來源的蛋白酶液。