[發明專利]一種蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定細菌胞外蛋白酶種類上的應用

有效

• 申請號: 201410309658.0
• 申請日: 2014-07-01
• 公開（公告）號: CN104122317B
• 公開（公告）日: 2017-03-29
• 發明（設計）人: 何海倫;劉丹;武翠玲;楊興昊;吳日幫;黃嘉封;黃雅雯
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所43114
• 代理人: 袁靖

技術領域

本發明屬于蛋白酶種類鑒定技術領域，涉及一種利用蛋白酶譜的活性電泳檢測技術和蛋白酶抑制劑反應對蛋白酶種類進行快速鑒定的應用方法。

背景技術

蛋白酶(proteases,proteinases)也稱為肽酶(peptidases)，是一類能水解蛋白質和多肽水解的酶類，廣泛存在于動物、植物和微生物中，執行許多不同的生理功能。MEROPS數據庫記錄了蛋白酶及蛋白酶的肽類抑制劑的相關信息，根據催化中心參與催化的氨基酸的不同，在該數據庫中蛋白酶可分成6大類：天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶和未知催化類型的蛋白酶。蛋白酶是用途最廣泛的酶制劑之一，占了世界酶類銷售總額的60％，在食品、醫藥、紡織、制革、洗滌劑、化妝品、動植物蛋白以及廢物處理等行業都有著很好的應用前景。

蛋白酶抑制劑(protease?inhibitor,PI)是一類分子量較小的多肽或蛋白質，它們能與蛋白酶活性部位或變構部位結合抑制酶的活性。蛋白酶抑制劑根據其作用于酶的活性部位的不同，分為絲氨酸蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑(巰基蛋白酶抑制劑)、金屬羧肽酶蛋白酶抑制劑和天冬氨酸蛋白酶抑制劑。利用蛋白酶抑制劑可以研究蛋白酶活性中心的催化特性，初步推斷蛋白酶的種類。

利用蛋白酶抑制劑檢測蛋白酶的常規方法為，將蛋白酶與抑制劑混合反應后，根據福林酚法測定其對酪蛋白的酶活。該方法中使用的如果是純酶，則可以直觀的判斷蛋白酶的類型，但如果是粗酶提取液，結果就不直觀，那是由于粗酶液內含多種蛋白酶，利用該方法，只能粗略判斷粗酶液中可能含有哪種類型的酶，并不能直觀的看到具體是哪一種或幾種蛋白酶被抑制。

本發明針對上述問題進行了技術改進，利用蛋白酶譜的活性電泳產物通過抑制劑加底物浸泡的方法解決了上述傳統方法可能的造成的誤差，可有效應用于蛋白酶譜定性的分析。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種更為快速、準確、簡便的檢測蛋白酶種類的新方法，應用該方法，可以不用分離純化蛋白酶，不使用昂貴儀器，就可直觀的對細菌胞外蛋白酶進行分類。大大的縮短了實驗周期，實現對多種蛋白酶譜進行高通量快速檢測。

本發明的目的是通過以下方式實現的：

一種蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應用方法，包括以下步驟：

a.制備不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酰胺凝膠；

b.蛋白酶樣品與不含β-巰基乙醇的加樣緩沖液混勻后加樣，且加樣時樣品不在沸水浴中加熱；

c.電泳；

d.洗膠；

e.將膠放入含有不同蛋白酶抑制劑的底物溶液中浸泡；

f.反應顯色。

步驟a制備不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酰胺凝膠的過程如下：配制質量濃度為12.5％的分離膠：30％w/v凝膠貯備液1.6ml，pH8.8的1.5mol/L?Tris-HCl1.0ml，蒸餾水1.4ml，10％w/v過硫酸銨25μl，TEMED2.5μl；混勻后立即將分離膠注入準備好的玻璃板間隙中，用滴管輕輕在其頂層加入1ml蒸餾水，以阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用；聚合完成之后，倒掉覆蓋液體；配制5％w/v的上層濃縮膠：30％w/v凝膠貯備液0.15ml，pH6.8的0.5mol/L?Tris-HCl0.35ml，蒸餾水0.5ml，10％w/v過硫酸銨20μl，TEMED2.0μl；插入梳子，避免混入氣泡，放置室溫下。

步驟b中使用的不含β-巰基乙醇的加樣緩沖液配方為：60mM?Tris-HCl?pH6.8、SDS2％w/v、溴酚藍0.1％w/v、甘油25％v/v組成，加樣時樣品和加樣緩沖液的體積比為4：1。

4、根據權利要求1所述的蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應用方法，其特征在于，

步驟c中電泳緩沖液為pH8.8的Tris-甘氨酸緩沖液；電泳在冰浴中進行；采用垂直板式不連續系統電泳方法，5mA穩流進樣后，10mA穩流分離樣品直至溴酚藍指示劑到達膠的最前沿。

步驟d中電泳結束后，用預冷的2.5％Triton?X-100v/v將膠洗三次，每次15min；然后用預冷的蒸餾水漂洗數次去除殘留的Triton?X-100。

步驟e中將膠浸泡在用Tris-HCl緩沖液配制的含有5mM蛋白酶抑制劑和質量濃度為0.1-2％底物的溶液中，30-40℃溫浴1-3h。