[發明專利]一種結核分枝桿菌利福平耐藥突變的檢測方法及試劑盒和應用

在審

• 申請號: 201410309303.1
• 申請日: 2014-06-30
• 公開（公告）號: CN105219843A
• 公開（公告）日: 2016-01-06
• 發明（設計）人: 張馳宇;樊路娟;姚瑾;藍柯
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海巴斯德研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 馬莉華;崔佳佳

技術領域

本發明屬于分子生物學檢測領域，具體地，本發明涉及一種結核分枝桿菌利福平耐藥突變的檢測方法及試劑盒，更具體地說，本發明涉及一種結核分枝桿菌利福平耐藥突變的檢測方法及試劑盒和應用。本發明還提供了設計在rpoB基因利福平耐藥決定區相關區域的、具有高度的特異性的引物組。

背景技術

結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)簡稱結核桿菌(TB),于1882年由德國細菌學家郭霍(RobertKoch)從肺結核病人痰標本中發現，是結核病的病原菌。結核病是一種具有強傳染性的慢性消耗性疾病，其發病率較高，危害性極大，19世紀時被稱為“白色瘟疫”。世界衛生組織(WHO)已將結核病與艾滋病、瘧疾列為二十一世紀人類需要攻克的三大傳染性疾病之一，1993年，WHO宣布全球結核病處于“緊急狀態”，并于1995年起將每年的3月24日定為“世界防治結核病日”，以提醒公眾加深對結核病的認識。據WHO報告，全球約20億人曾受到結核分枝桿菌感染，現有肺結核病人約2000萬，每年新發病例800萬～1000萬，每年死于結核病的人數約300萬。我國是結核病第二大國，僅次于印度，估計全國現有活動性肺結核病人450萬，每年新發病例130萬，相當于其他傳染病的總和。

利福平(Rifampicin，RFP)是抗結核聯合化療中主要的一線藥物，在細菌中的靶蛋白為RNA聚合酶β亞基，與之結合后，阻礙mRNA合成，抑制轉錄過程，阻斷細菌的蛋白質合成，從而達到抑菌作用。

結核耐藥性快速診斷方法對結核病的防治具有重要價值。現有的結核分枝桿菌利福平耐藥性檢測所使用的方法，有絕對濃度法、RFLP法和測序法等。

其中，絕對濃度法存在著二次培養，每次八周，周期長且污染機率高；RFLP法由于采用限制性內切酶，而RFP耐藥決定區內缺少合適的酶切位點，導致rpoB基因突變的檢出率僅為10％，不能滿足臨床診斷的要求；雖然測序法是突變檢測的“金標準”，但敏感性低(15％～20％)，且陰性率高。

在過去的幾十年里涌現出了越來越多的SNPs分析技術，這些技術大致可以分為兩類：等位基因特異性區分法以及直接測序法。其中，等位基因特異性區分策略主要是基于等位基因特異性反應，包括：引物延伸、雜交、連接、限制性酶切等方法。但是這些方法都不夠理想，它們中，有的方法需要復雜的操作和昂貴的儀器，有的方法靈敏度和特異性不佳，無法檢測稀有突變，這些都限制了它們的廣泛應用。例如，SNP檢測技術中最常見的等位基因特異性PCR技術(allelic-specificPCR，AS-PCR)，雖然引物3'-末端和模板形成了錯配，但是大部分DNA聚合酶依然能夠催化引物的非特異性延伸，因而無法準確地判斷所測基因中是否存在SNP。

因此，本領域亟待研制和開發一種高度靈敏、準確的結核分枝桿菌利福平耐藥基因突變檢測技術，其對于早期診斷結核病和防治結核病的傳播具有重要的意義。

發明內容

本發明的目的就是提供一種高度靈敏、準確、特異性強的結核分枝桿菌利福平耐藥基因突變檢測手段、檢測試劑盒以及相關用途和應用。

在本發明的第一方面，提供了一種用于檢測結核分枝桿菌利福平耐藥相關基因的待測突變位點上是否存在突變的檢測試劑盒，所述試劑盒中包括：

正向引物和反向引物，

其中，所述正向引物和反向引物中一個引物為辨別性引物，所述辨別性引物以其3'末端堿基起算第1-8位的任意1個或多個堿基對應待測突變位點，但與野生型或突變型序列相應區段上堿基序列完全匹配，并且所述的辨別性引物的3'末端核苷戊糖3號C的羥基是雙脫氧修飾的C(即ddC)；

并且所述正向引物和反向引物中另一引物位于基因突變位點下游或上游且與相應區段上堿基序列完全匹配；

高保真DNA聚合酶；和

非高保真DNA聚合酶；

其中，所述的正向引物和/或反向引物用于擴增含所述待測突變位點的擴增產物；并且所述的待測突變位點選自下組：

rpoB基因的對應于rpoB蛋白中第516位氨基酸的密碼子序列、第526位氨基酸密碼子序列、第531位氨基酸的密碼子序列、或其組合。

在另一優選例中，所述的待測突變位點上的堿基序列突變形式選自下組：D516V、H526Y、H526R、S531L、或其組合。

在另一優選例中，所述的待測突變位點的堿基序列選自下組：GAC→GTC、CAC→TAC、CAC→CGC、TCG→TTG、或其組合。