[發明專利]基于AAV?ITR的基因表達微載體及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201410307720.2
• 申請日: 2014-06-30
• 公開（公告）號: CN104087613B
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: 張春;平菡;劉曉玫
• 申請（專利權）人: 中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 南京利豐知識產權代理事務所(特殊普通合伙)32256
• 代理人: 王鋒

技術領域

本發明涉及一種基因表達微載體，特別涉及一種新型的、基于腺相關病毒（AAV）倒置末端重復序列（ITR）的基因表達微載體（AAV-ITR Mini Vector）以及該基因表達微載體的構建方法和應用。

背景技術

基因治療(gene therapy)是指通過基因工程技術將外源正常基因導入靶細胞，替代異常基因、封閉或祛除致病基因、修復受損基因或重建調控系統等，以糾正或補償由于基因缺陷和異常所引起的疾病，從而到達治療疾病的目的。基因治療已被廣泛用于治療遺傳病、惡性腫瘤、心血管疾病、感染性疾病等，到2013年2月底為止，世界上已有1902種基因治療藥物進入臨床試驗中。基因治療的關鍵技術是選用合適的載體將外源基因有效導入受體靶細胞，并有效地進行外源基因表達。而基因治療的難點是載體的轉染、表達效率低以及存在安全隱患，因此研發能夠穩定轉染并且安全有效的基因治療載體是現今基因治療研究領域的重點。傳統的基因治療表達載體有病毒表達載體及質粒表達載體。盡管病毒載體具有轉染效率高、靶向性強的優點，但其潛在的致癌性、致毒風險、自身免疫原性和造成細胞病理改變等缺點在一定程度上限制了其在基因治療中的廣泛應用。質粒載體中含有細菌復制序列、抗性基因、未甲基化的CpG序列和一些可能隱藏的表達信號，這些序列在質粒復制時是必需的，但在基因治療過程中可能引發嚴重的安全性問題。所以研究開發具有穩定性、安全性和靶向性的非病毒載體日益受到重視。

發明內容

本發明的目的之一在于提供一種基于AAV-ITR的基因表達微載體，其在應用時能夠實現外源基因在宿主細胞內的高效、穩定、安全的表達，從而克服了現有技術中的不足。

本發明的目的之二在于提供一種構建前述基于AAV-ITR的基因表達微載體的方法。

本發明的目的之三在于提供前述基于AAV-ITR的基因表達微載體在表達外源基因中的應用。

為實現上述發明目的，本發明采用了如下技術方案：

一種基于AAV-ITR的基因表達微載體，包括用于表達外源基因的基因表達框，所述基因表達框兩端分別連接有AAV基因組的ITR序列。

進一步的，所述基因表達框包括線性表達框。

作為較為優選的實施方案之一，所述基因表達框包含在兩段AAV基因組的ITR序列之間依次分布的CMV 增強子、Chicken β-actin 啟動子、多克隆位點和SV40-Ploy(A)。

作為較為優選的實施方案之一，所述AAV基因組的ITR序列中不包含D序列。

一種基因表達載體質粒，其特征在于，包括如上任一項所述的基因表達微載體。

如上任一項所述基因表達微載體和所述基因表達載體質粒在宿主細胞內穩定表達外源基因的用途。

一種基于AAV-ITR的基因表達微載體的構建方法，包括：

（1）提供AAV-ITR表達框，并克隆在pUC57質粒的多克隆位點，獲得含有所述基因表達微載體序列的質粒pUC57-minivector，其中，所述基因表達微載體包括兩組AAV基因組的ITR序列，該兩組ITR序列之間分布有用于表達外源基因的基因表達框；

（2）將EGFP序列克隆至載體質粒pUC57-minivector，獲得微載體擴增質粒pUC57-minivector-EGFP；

（3）NotI 酶切微載體擴增質粒pUC57-minivector-EGFP，并回收目的片段ds-minivector-EGFP，而后依次進行熱變性和冷卻處理，獲得所述基因表達微載體。

作為較為優選的實施方案之一，該方法還可包括：

（2X）以pUC57-minivector-EGFP為模板，PCR擴增該兩組ITR序列中的兩組D序列之間的DNA片段，獲得微載體擴增質粒pUC57-minivector-ΔD –EGFP；以及，

（3X）參照步驟（3）的操作處理微載體擴增質粒pUC57-minivector-ΔD –EGFP，獲得不含D序列的所述基因表達微載體。

具體的，該方法包括：

（1）提供AAV-ITR表達框，并克隆在pUC57質粒的多克隆位點，獲得含有所述基因表達微載體序列的質粒pUC57-minivector；

（2）以含有EGFP的質粒pds-AAV-CB-EGFP為模板，通過PCR擴增得到EGFP序列，再將EGFP序列克隆至載體質粒pUC57-minivector，獲得微載體擴增質粒pUC57-minivector-EGFP；