[發明專利]基于AAV?ITR的基因表達微載體及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201410307720.2
• 申請日: 2014-06-30
• 公開（公告）號: CN104087613B
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: 張春;平菡;劉曉玫
• 申請（專利權）人: 中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 南京利豐知識產權代理事務所(特殊普通合伙)32256
• 代理人: 王鋒

1.一種基于AAV-ITR的基因表達微載體在宿主細胞內高效穩定表達外源基因的方法，其特征在于：

其中所述基于AAV-ITR的基因表達微載體包括用于表達外源基因的基因表達框，其中，所述基因表達框兩端分別連接有AAV基因組的ITR序列，所述基因表達框為線性表達框，并且所述基因表達框包含在兩段AAV基因組的ITR序列之間依次分布的CMV增強子、Chickenβ-actin啟動子、多克隆位點和SV40-Ploy(A)，所述AAV基因組的ITR序列中不包含D序列；

其步驟如下：

(1)提供AAV-ITR表達框，并克隆在pUC57質粒的多克隆位點，獲得含有基因表達微載體序列的質粒pUC57-minivector，其中，所述基因表達微載體包括兩組AAV基因組的ITR序列，該兩組ITR序列之間分布有用于表達外源基因的基因表達框；

(2)將EGFP序列克隆至載體質粒pUC57-minivector，獲得微載體擴增質粒pUC57-minivector-EGFP，再以pUC57-minivector-EGFP為模板，PCR擴增該兩組ITR序列中的兩組D序列之間的DNA片段，該PCR擴增采用的上游引物序列為5’-GCGTCTAGAGGTACCCTAGTTATTATTAGTAATC，下游引物序列為5’-GCG TCTAGATAA AAAACCTCCCACACCTCCC，通過XbaI酶切微載體擴增質粒pUC57-minivector-EGFP，并將其與PCR擴增得到的左、右D序列之間的片段連接獲得微載體擴增質粒pUC57-minivector-ΔD–EGFP；

(3)NotI酶切微載體擴增質粒pUC57-minivector-ΔD–EGFP，并回收目的片段，而后依次進行熱變性和冷卻處理，獲得不含D序列的所述基因表達微載體；

(4)在體外細胞中表達不含D序列的AAV-ITR的基因表達微載體。