[發(fā)明專利]一種測定血漿中5’-甲氧基-3’, 4’-亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基酰胺濃度的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410303081.2
• 申請日: 2014-06-27
• 公開（公告）號: CN104076116A
• 公開（公告）日: 2014-10-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張軍;儲繼紅;李長印;居文政;吳婷;許美娟;劉史佳
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省中醫(yī)院
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于藥物分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及體內(nèi)藥物的分析測定方法，具體涉及測定血漿中5’-甲氧基-3’,4’-亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基酰胺濃度的方法。?

背景技術(shù)

大葉蒟(Piper?Laetispicum?C.DC.)為胡椒科胡椒屬植物，主要產(chǎn)于海南、廣東、廣西、云南等地，民間用于活血、消腫、止痛，主治跌打損傷、瘀血腫痛。近期研究發(fā)現(xiàn)大葉蒟具有較強(qiáng)的抗抑郁作用，其活性和一系列酰胺類化合物有關(guān)。其中5’-甲氧基-3’,4’-亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基酰胺(C15H19NO4)(K6)為其中含量最高的生物堿。?

目前關(guān)于人體服用大葉蒟有效部位提取物后血漿中K6的測定方法沒有文獻(xiàn)報(bào)道。本發(fā)明建立了大葉蒟有效部位提取物中主要有效成分K6在人體內(nèi)的測定方法，通過該方法對K6在人體內(nèi)的藥物代謝情況進(jìn)行探索性研究，以期服務(wù)于新藥開發(fā)。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種測定血漿中5’-甲氧基-3’,4’-亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基酰胺濃度的方法。?

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：?

一種測定血漿中5’-甲氧基-3’,4’-亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基酰胺(K6)濃度的方法，血漿樣品經(jīng)預(yù)處理后經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)檢測其濃度，具體方法包括如下步驟：?

(1)血漿樣品預(yù)處理：取血漿樣品，加入內(nèi)標(biāo)替硝唑溶液，加入乙酸乙酯萃取，吸取上層有機(jī)相，40℃下減壓濃縮揮干，加入80v/v％甲醇水溶液溶解，離心后取上清液；?

(2)將步驟(1)預(yù)處理后的血漿樣品進(jìn)行液相色譜分離：色譜柱為Agilent?ZOBAX?SB?C18，4.6×150mm，5μm；流動(dòng)相：體積比為80:20的甲醇與0.2mmol·L^-1醋酸胺水溶液；流速：400mL·min^-1；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：5μL；洗脫方式為等度洗脫；?

(3)質(zhì)譜測定：條件為：離子源：電噴霧離子化電離源ESI；離子檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；離子極性：正離子；離子源電壓IS：5000V；離子源溫度TEM：400℃；?碰撞氣CAD：10L·min^-1；氣簾氣CUR：20L·min^-1；離子源Gas1：60L·min^-1；離子源Gas2：70L·min^-1；檢測對象的離子選擇通道：5’-甲氧基-3’,4’-亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基酰胺，[M+H]+，m/z278.1/205.1，DP140，EP10，CE21，CXP9；內(nèi)標(biāo)替硝唑，[M+H]+，m/z248.1/128.0，DP100，EP10，CE30，CXP8；?

(4)計(jì)算：采用內(nèi)標(biāo)法，以5’-甲氧基-3’,4’-亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基酰胺和內(nèi)標(biāo)替硝唑的峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算5’-甲氧基-3’,4’-亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基酰胺濃度。?

步驟(1)中，于10.0mL玻璃試管中精密加入血漿樣品0.5mL，精密加入內(nèi)標(biāo)105.6ng·mL^-1替硝唑溶液20μL，旋渦10s，加入4.0mL乙酸乙酯，旋渦振蕩3min，3000r·min^-1離心10min，吸取上層有機(jī)相4mL，40℃下減壓濃縮揮干，加入100μL80v/v％甲醇水溶液復(fù)溶，旋渦1min，12000r·min^-1離心5min，吸取上清液。?

其中，所述的血漿為口服大葉蒟有效部位提取物后的血漿。本發(fā)明對大葉蒟有效部位提取物如何制備沒有具體限定，現(xiàn)有的制備方法都可以采用。本發(fā)明方法重點(diǎn)是保護(hù)口服大葉蒟有效部位提取物后，血漿內(nèi)K6的檢測方法，從而為研究K6的體內(nèi)代謝奠定基礎(chǔ)。?

其中，所述血漿為人或動(dòng)物的血漿。?

有益效果：本發(fā)明方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)勢：?

(1)預(yù)處理方法簡便：有機(jī)溶媒液液萃取法，適用于常規(guī)測定。?

(2)專屬性強(qiáng)：采用ZOBAX?SB?C18色譜柱作為固定相，甲醇和水(0.2mmol·L^-1醋酸胺)的混合液作為流動(dòng)相，等度洗脫，K6保留時(shí)間為5.3min左右，內(nèi)標(biāo)替硝唑保留時(shí)間為3.7min左右，6.5分鐘完成測定，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾二者的測定。?

(3)靈敏度高：血漿最低定量限為0.1006ng·mL^-1。?