[發明專利]一種利用木糖產聚羥基烷酸酯菌群的篩選和馴化方法

有效

• 申請號: 201410302267.6
• 申請日: 2014-06-27
• 公開（公告）號: CN104031906B
• 公開（公告）日: 2016-11-30
• 發明（設計）人: 賈曉強;劉英杰
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N13/00
• 分類號: C12N13/00;C12N15/01;C12N1/20;C12R1/01;C12R1/40
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 王麗

技術領域

本發明涉及一種高效利用木糖產聚羥基烷酸酯菌群的篩選和馴化方法。

背景技術

聚羥基烷酸酯(polyhydroxyalkanoates?PHA)是許多細菌在生長不平衡條件下合成的碳源儲藏性顆粒，作為一種可再生、可生物降解塑料受到人們青睞。它除具有與傳統塑料相近的性質，還兼有生物相容、光學活性等特性，成為塑料的良好替代品，在解決環境污染和能源緊張方面具有很大的潛力。目前，PHA主要采用純菌發酵生產，包括產堿桿菌、固氮菌、假單胞菌以及重組大腸桿菌等。但純菌發酵需使用葡萄糖等優質底物，以及滅菌等發酵控制工藝造成PHA生產成本昂貴，高于傳統塑料的5-10倍[1]。高昂的價格嚴重阻礙了PHA的市場需求和使用。

纖維素生物質材料作為地球上最為豐富的可再生資源，廣泛存在于秸稈等各種農林產品及其加工廢棄物中，但纖維素生物質結構致密，很難被生物利用，導致這些可再生資源并沒有得到大規模的回收再利用。木質纖維素原料中，木糖的含量達18％～30％，是自然界中第二大的糖類物質[2]。因此許多學者通過人工篩選或構建獲得利用木糖產PHA菌株，以期利用木糖產PHA，為以纖維素為原料產PHA奠定基礎，從而大幅降低PHA的生產成本。但是目前單菌利用木糖產PJHAs的能力仍十分有限，最大產量僅達到3g/l左右[3,4]，遠遠無法滿足工業生產的要求。

微生物普遍以多細胞體系存在于自然界，99％的微生物不可純培養。利用廣泛分布于自然界的微生物多細胞體系為人類生產生活服務，是一種低成本、高效益的經濟模式，同時相對于單菌，混菌的穩定性高，魯棒性好，能耐受多變的環境完成更加復雜的生物功能[5]，因此已經在醫藥、食品釀造、環境保護、能源資源等領域得到廣泛應用。同時混菌發酵使用開放系統，無需滅菌等操作成本，所以混合菌群利用木糖產PHA可以顯著降低PHA的成本。但是，對PHA合成菌株缺乏合適的馴化篩選壓力，傳統的飽食饑餓模式和厭氧好養模式馴化周期長，并且需要以小分子脂肪酸類物質為馴化底物，因此目前尚無混合菌群利用木糖產PHA的報道。

[1]K?Sudesh,K?Bhubalan,JA?Chuah,et?al.Synthesis?of?polyhydroxyalkanoate?from?palm?oil?and?some?new?applications.App?Microbiol?and?Biot,2010,89:1373-1386

[2]徐勇,王滎,朱均均,勇強,余世袁.木糖高效生物轉化的新出路[J].中國生物工程雜志(China?Biotechnology),2012,32(005):113-119

[3]FK?Young,JR?Kastner,SW?May.Microbial?Production?of?poly-β-hydroxybutyric?acid?from?d-xylose?and?lactose?by?Pseudomonas?cepacia.Appl?Environ?Microb,1994,60:4195-4198

[4]R?Li,Q?Chen,PG?Wang,et?al.A?novel-designed?Escherichia?coli?for?the?production?of?various?polyhydroxyalkanoates?from?inexpensive?substrate?mixture.Appl?Microbiol?Biot,2007,75:1103-1109

[5]K?Brenner,L?You,FH?Arnold.Engineering?microbial?consortia:a?new?frontier?in?synthetic?biology.Trends?Biotechnol,2008,26:483-489

發明內容

鑒于上述，本發明提供了一種高效利用木糖產PHA菌群的篩選和馴化方法——使用飽食饑餓模式馴化結合尼羅藍染色篩選的方法對菌群施加明確的篩選壓力。

本發明的技術方案如下：

以富含混合菌群的活性污泥為原料，利用混合菌群產PHA的飽食饑餓馴化模式進行馴化，馴化過程中取樣，使用尼羅藍染色法進行PHA合成菌群的篩選；篩選得到的PHA高產菌群富集培養后回注到正在馴化中的體系中，對馴化中的菌群進行擾動；馴化結束后使用得到的混菌體系進行PHA發酵生產，發酵結束后進行PHA提取。

所述的飽食饑餓馴化模式是包括進料、通氣，沉降和排水四個步驟為一個培養周期。