[發(fā)明專利]具有搖臂結(jié)構(gòu)磁性多孔殼聚糖固定化酶載體的制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410299754.1
• 申請(qǐng)日: 2014-06-27
• 公開（公告）號(hào): CN104046611A
• 公開（公告）日: 2014-09-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張秋禹;田雷;李偉;張寶亮;張和鵬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西北工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N11/14
• 分類號(hào): C12N11/14;C12N11/10
• 代理公司: 西北工業(yè)大學(xué)專利中心 61204
• 代理人: 王鮮凱

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于固定化酶載體的制備方法，具體涉及一種具有搖臂結(jié)構(gòu)磁性多孔殼聚糖固定化酶載體的制備方法。

背景技術(shù)

酶是一種具有催化功能的活性生物大分子，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥，發(fā)酵，化工，環(huán)保，檢測(cè)等各個(gè)領(lǐng)域，與一般催化劑相比，酶具有催化效率高，底物專一性強(qiáng)，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)過程便于控制的優(yōu)點(diǎn)。但游離酶對(duì)環(huán)境敏感，難于與產(chǎn)物分離，另外難于重復(fù)使用。固定化酶可以克服上述游離酶的缺點(diǎn)。

對(duì)于固定化酶，載體材料的結(jié)構(gòu)和性能對(duì)固定化酶的有效固載量、固載穩(wěn)定性以及催化活性有著巨大的影響。殼聚糖由于其機(jī)械性能好,化學(xué)性能穩(wěn)定,且具有可生物降解、固定化酶效率高等諸多優(yōu)點(diǎn)而在固定化酶技術(shù)中廣泛應(yīng)用，殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中含有游離-NH₂和-OH，不僅具有較高的生物活性，而且具有配位螯合功能。

柯葉芳等采用殼聚糖將脂肪酶固定于Fe₃O₄粒子表面制成磁性微球，并將其應(yīng)用于(R,S)-1-苯乙醇的生物拆分該方法具有操作簡(jiǎn)便酶載量大且易分離，可廣泛應(yīng)用于各種生物催化反應(yīng)。劉博等以殼聚糖、海藻酸鈉為微載體制備材料，采用脈沖電場(chǎng)液滴工藝制備殼聚糖/海藻酸鈣微膠囊應(yīng)用于脂肪酶的固定化。但是以殼聚糖凝膠作為載體固定化酶時(shí)，液體流通性不好，難于進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的連續(xù)操作；與殼聚糖聯(lián)用的醛可能會(huì)使酶失活，殼聚糖自身也可能會(huì)被酶降解。

發(fā)明內(nèi)容

要解決的技術(shù)問題

為了避免現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明提出一種具有搖臂結(jié)構(gòu)磁性多孔殼聚糖固定化酶載體的制備方法，通過反相體系制備得到磁性多孔殼聚糖微球，再通過與修飾劑反應(yīng)在磁性多孔殼聚糖上接上搖臂，實(shí)現(xiàn)對(duì)酶的固定化。

技術(shù)方案

一種具有搖臂結(jié)構(gòu)磁性多孔殼聚糖固定化酶載體的制備方法，其特征在于步驟如下：

步驟1：配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1～1％的Span-80液體石蠟溶液作為油相；

步驟2：將致孔劑和磁性納米粒子分散在水中，加入殼聚糖及冰醋酸，混合溶解配成水相；所述致孔劑、磁性納米粒子、殼聚糖、冰醋酸及水的質(zhì)量比為1﹕1～0.4﹕1～6﹕10～50﹕400～1000；

步驟3：將得到的水相和油相按照質(zhì)量比1﹕3～7混合攪拌20～60min，得到反相乳液；

步驟4：在反相乳液中加入戊二醛和0.1M的NaOH水溶液，升溫至70～90℃，再加入等比例的戊二醛，反應(yīng)6～12h，得到分散有黑褐色顆粒的溶液；所述戊二醛、NaOH水溶液與殼聚糖的質(zhì)量比為0.05～0.5﹕1～5﹕1；

步驟5：對(duì)步驟4中得到的分散有黑褐色顆粒的溶液在磁場(chǎng)下進(jìn)行產(chǎn)物分離，得到黑褐色顆粒；采用乙醇、0.1M的鹽酸水溶液對(duì)黑褐色顆粒各洗滌三次，水洗至中性后干燥得磁性多孔殼聚糖固定化酶載體；

步驟6：將修飾劑溶于甲醇和醋酸混合溶液中，再加入磁性多孔殼聚糖固定化酶載體，在室溫下攪拌混合；所述甲醇和醋酸的體積比為1:1；所述修飾劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2～1％；所述磁性多孔殼聚糖固定化酶載體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2～10％；

步驟7：調(diào)節(jié)步驟6體系的PH值為6～6.5，反應(yīng)2h后，經(jīng)磁場(chǎng)分離，乙醇、水各洗滌3次，干燥后得到具有搖臂結(jié)構(gòu)磁性多孔殼聚糖固定化酶載體。

所述步驟2的攪拌速度為100～500r/min。

所述步驟6的攪拌混合為1h，攪拌速度為100～300r/min。

所述步驟2中的致孔劑為CaCO₃、Mg(OH)₂、BaCO₃、Al(OH)₃、Ca(OH)₂、Al₂O₃中的一種或者幾種的任意比混合。

所述步驟2中磁性納米粒子為Fe₃O₄、Fe₂O₃、錳鐵氧體、鋅鐵氧體中的一種或幾種的任意比混合。

所述步驟6中的修飾劑為雙氨基聚乙二醇、雙羧基聚乙二醇、雙醛基聚乙二醇或羧基-聚乙二醇-氨基。

有益效果

本發(fā)明提出的一種具有搖臂結(jié)構(gòu)磁性多孔殼聚糖固定化酶載體的制備方法，通過反相體系制備得到磁性殼聚糖微球，用稀鹽酸除去致孔劑得到磁性多孔殼聚糖，再通過與修飾劑反應(yīng)在磁性多孔殼聚糖上接上搖臂，實(shí)現(xiàn)對(duì)酶的固定化。

附圖說明

圖1：搖臂結(jié)構(gòu)磁性多孔殼聚糖固定化酶載體的制備流程圖

具體實(shí)施方式