[發(fā)明專利]一種特異性檢測EGFR的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410298015.0
• 申請日: 2014-06-26
• 公開（公告）號: CN104017900A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫侖泉;楊力芳;林奕婷
• 申請（專利權(quán)）人: 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京萬象新悅知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11360
• 代理人: 李稚婷

1.一種特異性檢測EGFR的方法，根據(jù)EGFR的mRNA序列，設(shè)計(jì)PCR引物，在下游PCR引物的5’端加上脫氧核酶的反義序列，并在反應(yīng)體系中加入該脫氧核酶的特異標(biāo)記底物，該特異標(biāo)記底物的上下游分別標(biāo)記了熒光發(fā)射基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)；PCR擴(kuò)增產(chǎn)生脫氧核酶的正義序列，產(chǎn)生具有切割活性的脫氧核酶并切斷特異標(biāo)記底物，使淬滅作用消失，產(chǎn)生熒光信號；根據(jù)熒光信號與PCR產(chǎn)物之間的對應(yīng)關(guān)系，對EGFR進(jìn)行定量或突變檢測。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述特異標(biāo)記底物由19～21核苷酸殘基組成；特異標(biāo)記底物中間含AU或GU序列，其上下游分別標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述脫氧核酶的正義序列由與特異標(biāo)記底物配對的結(jié)合序列和GGCTAGCTACAACGA催化功能序列連接組成。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述脫氧核酶的正義序列由29～33個(gè)核苷酸殘基組成，其中所述與特異標(biāo)記底物配對的結(jié)合序列包括分別位于所述催化功能序列5’端和3’端的兩段序列，各具有7～9個(gè)核苷酸殘基。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述脫氧核酶的正義序列選自序列表中的SEQ?ID?No：1～4中的任意一個(gè)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述特異標(biāo)記底物序列選自序列表中的SEQ?ID?No：5～8中的任意一個(gè)，它們依次分別對應(yīng)SEQ?ID?No：1～4所示的脫氧核酶的正義序列。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR引物與EGFR?mRNA序列配對區(qū)域的長度為15～25核苷酸殘基。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，5’端加上脫氧核酶的反義序列的PCR引物序列選自序列表中的SEQ?ID?No：9～12中的一個(gè)。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述熒光發(fā)射基團(tuán)選自FAM、HEX、TET、ROX、Cy3和Cy5中的一種；所述熒光淬滅基團(tuán)選自TAMRA、Eclipse和BHQ系列熒光染料中的一種。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，以6-FAM為熒光發(fā)射基團(tuán)，TAMRA為熒光淬滅基團(tuán)，ROX為參比熒光。