[發(fā)明專利]運(yùn)動發(fā)酵單胞菌-大腸桿菌穿梭載體pSUZM系列及其構(gòu)建方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410296217.1
• 申請日: 2014-06-27
• 公開（公告）號: CN104031932A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 譚雪梅;曹慶華;張義正;王海燕;馮紅
• 申請（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/66
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及運(yùn)動發(fā)酵單胞菌-大腸桿菌穿梭載體pSUZM1、pSUZM2、pSUZM3及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

能源安全和環(huán)境問題作為全世界共同關(guān)注的焦點(diǎn)，燃料乙醇作為一種優(yōu)良的可替代能源引起了研究者的廣泛關(guān)注。運(yùn)動發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis，Z.mobilis)在生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用前景越來越受到廣泛關(guān)注，它不僅可用于生產(chǎn)重要的化工產(chǎn)品，而且可用于產(chǎn)生燃料乙醇。與釀酒酵母和其他燃料乙醇基因工程菌相比較，運(yùn)動發(fā)酵單胞菌具備許多突出的優(yōu)點(diǎn)，比如吸收糖效率高，產(chǎn)生物量少;?發(fā)酵時無需控制加氧;?耐高滲透壓和易于基因操作;?乙醇耐受性強(qiáng)，理想的乙醇產(chǎn)量等等。但是，運(yùn)動發(fā)酵單胞菌也具有一些不足之處，如底物范圍過窄，不能利用復(fù)雜的碳水化合物轉(zhuǎn)化為乙醇。除此之外，該細(xì)菌在發(fā)酵時對醪液中的鹽類﹑pH﹑抑制劑比較敏感，因而需對生產(chǎn)過程進(jìn)行嚴(yán)格控制。為滿足對該菌的基礎(chǔ)研究和工業(yè)應(yīng)用的要求，需要創(chuàng)建不同的基因工程菌株，因此首先需要有優(yōu)良的載體系統(tǒng)。

基因組DNA的復(fù)制對于一個細(xì)胞來說是極其重要的。原核生物的基因組具有一個或多個染色體，且多為環(huán)形，真細(xì)菌染色體的復(fù)制起點(diǎn)僅有一個，古細(xì)菌的染色體復(fù)制起點(diǎn)則為單個或多個。其中，真細(xì)菌的復(fù)制起始位點(diǎn)（oriC）片段長度從100bp到1000bp不等，染色體從此處開始復(fù)制，以雙復(fù)制叉的形式前行，在復(fù)制終點(diǎn)(terC)結(jié)束。絕大多數(shù)細(xì)菌的oriC位點(diǎn)位于dnaA基因附近，個別位于gidA和rpmH基因之間，或者靠近hemE基因。

細(xì)菌質(zhì)粒主要有theta?(θ)和滾環(huán)兩種復(fù)制形式，θ型復(fù)制與細(xì)菌基因組復(fù)制形式相似，由RNA?聚合脢(RNA?polymerase)和DNA聚合脢(DNA?polymerase)共同作用，以雙復(fù)制叉的形式向兩端進(jìn)行延伸。滾環(huán)復(fù)制與部分噬菌體的復(fù)制形式相似，質(zhì)粒雙鏈中的一條鏈在復(fù)制起始位點(diǎn)區(qū)被質(zhì)粒編碼起始蛋白（plasmid-encoded?initiator-protein,Rep）切開，然后環(huán)狀鏈和線狀鏈分別進(jìn)行復(fù)制。滾環(huán)復(fù)制質(zhì)粒最早是在Staphylococcusaureus中被發(fā)現(xiàn)，隨后在Bacillus?subtilis,?Clostridium?butyricum,?Brevibacteriumlactofermentum等革蘭氏陽性菌中均有發(fā)現(xiàn)，而Zymomonasmobilis，Bacteroides,?cyanobacteria，Helicobacter?pylori等革蘭氏陰性菌中質(zhì)粒的復(fù)制也屬于該復(fù)制形式。滾環(huán)復(fù)制質(zhì)粒的大小從1.3kb到10kb不等，具有精簡的結(jié)構(gòu)，質(zhì)粒上基因的轉(zhuǎn)錄方向大多相一致。Arvanitis等對Z.mobilis?10988內(nèi)源性質(zhì)粒pZMO1和pZMO2的特征和復(fù)制相關(guān)組分進(jìn)行了研究，將質(zhì)粒pZMO1線性化后克隆到pUC19中測序，全長為1651?bp，G+C含量為38%，其中開放閱讀框(ORFZMO1)編碼348個氨基酸，與其他革蘭氏陰性菌滾環(huán)復(fù)制質(zhì)粒的復(fù)制蛋白高度同源。質(zhì)粒pZMO2全長為1669?bp，G+C含量為38.5，開放閱讀框(ORFZMO2)編碼184個氨基酸，其N-端與滾環(huán)復(fù)制質(zhì)粒的復(fù)制蛋白高度同源。

運(yùn)動發(fā)酵單胞菌自身的不足限制了其在基礎(chǔ)研究和生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用，其中一個主要的瓶頸便是缺乏基因工程菌株。為了獲得乙醇生產(chǎn)效率高且又能利用多種碳源的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌基因工程菌，最為有效的方法是對其進(jìn)行遺傳改造，常規(guī)的遺傳方法是利用載體攜帶感興趣的外源基因，其編碼的蛋白質(zhì)使運(yùn)動發(fā)酵單胞菌獲得相應(yīng)的功能。運(yùn)動發(fā)酵單胞菌現(xiàn)有的常用載體主要有，光譜載體pBBR1MCS系列和RSF1010系列等，但這些載體均有一定的缺陷，其中pBBR1MCS系列存在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，而載體RSF1010系列則載體偏大。因此，將運(yùn)動發(fā)酵單胞菌內(nèi)源性質(zhì)粒和大腸桿菌的質(zhì)粒進(jìn)行有效整合后形成大小較為合適的穿梭載體，這種類型的載體既能在大腸桿菌中復(fù)制，又能在運(yùn)動發(fā)酵單胞菌中復(fù)制，且在運(yùn)動發(fā)酵單胞菌中能夠穩(wěn)定的遺傳，具有很好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供運(yùn)動發(fā)酵單胞菌-大腸桿菌穿梭載體pSUZM1、pSUZM2和pSUZM3及其構(gòu)建方法。

本發(fā)明提供的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌-大腸桿菌穿梭載體pSUZM1、pSUZM2和pSUZM3是一類環(huán)狀載體。

其中復(fù)制載體pSUZM1包含來自于運(yùn)動發(fā)酵單胞菌染色體上復(fù)制起點(diǎn)oriC、來自于質(zhì)粒pUC18上的大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)，卡那霉素篩選標(biāo)記基因。