[發明專利]運動發酵單胞菌-大腸桿菌穿梭載體pSUZM系列及其構建方法無效
| 申請號： | 201410296217.1 | 申請日： | 2014-06-27 |
| 公開（公告）號： | CN104031932A | 公開（公告）日： | 2014-09-10 |
| 發明（設計）人： | 譚雪梅;曹慶華;張義正;王海燕;馮紅 | 申請（專利權）人： | 四川大學 |
| 主分類號： | C12N15/74 | 分類號： | C12N15/74;C12N15/66 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 610065 四川*** | 國省代碼： | 四川;51 |
| 權利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 運動 發酵 單胞菌 大腸桿菌 穿梭 載體 psuzm 系列 及其 構建 方法 | ||
1.一類能在運動發酵單胞菌-大腸桿菌中穿梭的環狀載體pSUZM1、pSUZM2和pSUZM3，包含兩個原核復制起點，篩選標記基因。
2.根據權利1所述的載體，其特征在于：pSUZM1包含來自于運動發酵單胞菌染色體上復制起點oriC和來自于質粒pUC18上的大腸桿菌質粒復制起點，卡那霉素篩選標記基因；pSUZM2包含來自于運動發酵單胞菌內源性質粒pZZM401的復制起點、DNA復制蛋白基因序列和來自于質粒pUC18上的大腸桿菌質粒復制起點、卡那霉素篩選標記基因；pSUZM3包含來自于運動發酵內源性質粒pZZM402上的復制起點、DNA復制蛋白基因序列和來自于質粒pUC18上的大腸桿菌質粒復制起點、卡那霉素篩選標記基因。
3.權利2所述的載體的構建方法，包括如下步驟：
1）pSUZM1的構建方法，包括如下步驟：
(1)以CTAB法分別提取運動發酵單胞菌DNA；
(2)以運動發酵單胞菌全基因組DNA為模板，用以下引物5’-GGCACGACAGGTTTCCTCTTCGACCAGCGGTAAG-3’和5’-CCCACTGCAAGCTACCTTCAGTCGCGGCTTCTACC-3’進行PCR擴增，得到運動發酵單胞菌復制起點片段oriC；
(3)?以載體pUC18模板，用以下引物5’-GGGCTTCGGAATCGAGGATCTAGGTGAAGATCC-3’和5’-CTTACCGCTGGTCGAAGAGGAAACCTGTCGTGCC-3’，進行PCR擴增，得到大腸桿菌質粒復制起點片段oriE-1；
(4)以載體pBBR1MCS-2為模板，用以下引物5’-GGTAGAAGCCGCGACTGAAGGTAGCTTGCAGTGGG-3’和5’-GGATCTTCACCTAGATCCTCGATTCCGAAGCCC-3’，進行PCR擴增，得到篩選標記基因片段kan-1；
(5）將3個PCR產物oriC、oriE-1和kan-1分別經電泳凝膠回收后等摩爾混合，混合片段用T4?DNA聚合酶進行處理，然后進行退火反應重組，轉化大腸桿菌，獲得權利要求2所述的載體pSUZM1；
2)pSUZM2的構建方法，包括如下步驟：
(1)以CTAB法分別提取運動發酵單胞菌DNA；
(2)以運動發酵單胞菌全基因組DNA為模板，用以下引物5’-GGCACGACAGGTTTCCGCACCGCAAAGGACATG??-3’和5’-?CCCACTGCAAGCTACCTCGATTAACCGCAGGATTACG?-3’進行PCR擴增，得到運動發酵單胞菌質粒pZZM401的復制起點和DNA復制酶基因片段oriP1；
(3)以載體pUC18模板，用以下引物5’-GGGCTTCGGAATCGAGGATCTAGGTGAAGATCC?-3’和5’-?GCATGTCCTTTGCGGTGCGGAAACCTGTCGTGCC?-3’，進行PCR擴增，得到大腸桿菌質粒復制起點片段oriE-2；
(4)以載體pBBR1MCS-2為模板，用以下引物5’-CGTAATCCTGCGGTTAATCGAGGTAGCTTGCAGTGGG?-3’和5’-?GGATCTTCACCTAGATCCTCGATTCCGAAGCCC?-3’，進行PCR擴增，得到片段kan-2；
(5)將3個PCR產物oriP1、oriE-2和kan-2分別經電泳凝膠回收后等摩爾混合，混合片段用T4?DNA聚合酶進行處理，然后進行退火反應重組，轉化大腸桿菌，獲得權利要求2所述的載體pSUZM2；
3)?pSUZM3的構建方法，包括如下步驟：
(1)以CTAB法分別提取運動發酵單胞菌DNA；
(2)以運動發酵單胞菌全基因組DNA為模板，用以下引物5’-GGCACGACAGGTTTCCCGGAAAGGTCATCCTG?-3’和5’-?CCCACTGCAAGCTACCTCTGAGGCGACGACAG?-3’進行PCR擴增，得到運動發酵單胞菌質粒pZZM402的復制起點和DNA復制酶基因片段oriP2；
(3)以載體pUC18模板，用以下引物5’-GGGCTTCGGAATCGAGGATCTAGGTGAAGATCC?-3’和5’-?CAGGATGACCTTTCCGGGAAACCTGTCGTGCC?-3’，進行PCR擴增，得到大腸桿菌復制起點片段oriE-3；
(4)以載體pBBR1MCS-2為模板，用以下引物5’-CTTCTGTCGTCGCCTCAGAGGTAGCTTGCAGTGGG?-3’和5’-?GGATCTTCACCTAGATCCTCGATTCCGAAGCCC?-3’，進行PCR擴增，得到片段kan-3；
(5)將3個PCR產物oriP2、oriE-3和kan-3分別經電泳凝膠回收后等摩爾混合，混合片段用T4?DNA聚合酶進行處理，然后進行退火反應重組，轉化大腸桿菌，獲得權利要求2所述的載體pSUZM3。
該專利技術資料僅供研究查看技術是否侵權等信息，商用須獲得專利權人授權。該專利全部權利屬于四川大學，未經四川大學許可，擅自商用是侵權行為。如果您想購買此專利、獲得商業授權和技術合作，請聯系【客服】
本文鏈接：http://www.szxzyx.cn/pat/books/201410296217.1/1.html，轉載請聲明來源鉆瓜專利網。
