[發明專利]海馬的鑒定方法

在審

• 申請號: 201410294756.1
• 申請日: 2014-06-26
• 公開（公告）號: CN104017899A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 國錦琳;溫瓏蓮;侯飛俠;萬德光;彭成
• 申請（專利權）人: 成都中醫藥大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 成都希盛知識產權代理有限公司 51226
• 代理人: 柯海軍;武森濤

技術領域

本發明涉及海馬的鑒定方法，屬于分子生物學領域。

背景技術

目前，中藥材主要有以下幾種常用鑒定手段：基源鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定及理化鑒定等，而這些鑒定方法存在一定的缺陷：(1)中藥材的表型可塑性和遺傳可變性容易導致鑒定結果錯誤；(2)受生物性別和發育階段的限制；(3)無法準確鑒定許多群體中存在的隱存分類單元；(4)現代互式鑒定系統要求較高的專業技術知識和經驗，化學方法多不能用于物種鑒別。同時我國關于海馬的系統學和形態學研究幾乎為零。《中國魚類系統檢索》中根據較為簡單的形態特征對我國海馬屬的6個種進行了分類，不能稱為我國海馬形態鑒定的重要依據；2010年《中國藥典》對所收載的5個種進行了形態學描述，除H.kelloggi的描述較為詳細外，其他4個均較為簡略，不能有效的進行準確鑒別；《中國動物志》·海龍科也尚未出版，不能對我國海馬屬的動物準確物種鑒定有指導作用。

綜上，由于傳統形態學易受個體外觀形態和鑒定者主觀意識的影響的局限性，因此選擇穩定性高、通用性強、高效快捷的海馬的鑒定方法對市售海馬商品種進行準確鑒定和分類研究，根據研究結果完善和修訂市售海馬藥材的傳統形態鑒定，從而改善海馬藥材混亂的銷售現狀，加強海馬藥材的質量控制，提高海馬的臨床療效和臨床用藥安全，具有積極意義。

發明內容

本發明要解決的技術問題，是提供一種海馬的鑒定方法。

本發明海馬的鑒定方法，包括如下步驟：

a、提取海馬總DNA；

b、PCR擴增：對海馬總DNA進行PCR擴增，得COI基因序列；

c、PCR產物測序；

d、序列比對，確定海馬種類。

其中，COI指的是線粒體細胞色素C氧化酶亞基I，以COI這個特定的片段為DNA條形編碼的基礎，用于物種鑒定，又稱為DNA條形碼技術。

進一步的，提取海馬總DNA的方法可以采用常用的DNA提取方法，如改良CTAB法、高鹽法、SDS法、蛋白酶K法(酚—氯仿抽提法)和試劑盒法等，但為了提高提取效果，本發明優選采用試劑盒法提取海馬總DNA。

進一步的，引物的擴增效率是評價COI基因是否能夠成為DNA條形碼標準基因的重要依據，本發明海馬的鑒定方法，所述b步驟中PCR擴增的引物為FishF1、FishF2、FishR1和FishR2；其中，FishF1序列如Seq?ID?NO.1所示，即FishF1：5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’；FishF2序列如Seq?ID?NO.2所示，即FishF2：5’-TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3’；FishR1序列如Seq?ID?NO.3所示，即FishR1：5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’；FishR2序列如Seq?ID?NO.4所示，即FishR2：5’-ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3’。

進一步的，為了提高PCR擴增效率和增強PCR擴增效果，本發明海馬的鑒定方法中PCR擴增體系為25μl，其中，2×PCR?MixMaster12.5ul，FishF1?1ul，FishF2?1ul，FishR1?1ul，FishR2?1ul，海馬總DNA2ul，ddH₂O補足至25ul。

進一步的，為了獲得高濃度的擴增產物，本發明海馬的鑒定方法中PCR擴增反應程序為：95℃預變性2min；94℃0.5min；50℃0.5min；72℃1min；共35個循環；72℃延伸10min。

進一步的，為了檢測海馬總DNA滿足PCR擴增的要求，在a、b步驟之間，優選對海馬總DNA采用濃度為1.0％的瓊脂糖凝膠在恒壓150v、電流400mA的條件下進行電泳，電泳時間為10～20min，在全自動凝膠成像儀中對膠板進行拍照。

同樣地，為了檢測PCR產物濃度是否滿足測序要求，在b、c步驟之間，還對PCR產物進行電泳檢測，其采用濃度為1.0％的瓊脂糖凝膠在恒壓150v、電流400mA的條件下進行電泳，電泳時間為10～20min。

進一步的，將PCR擴增得到的序列與基因庫中的海馬序列進行比對，以此鑒定海馬的物種。

本發明有益效果：

(1)不受形態特征的限制，能在缺少形態特征而無法利用傳統形態分類法的情況下進行海馬物種的鑒別；