[發(fā)明專利]一種酒精長期保存后河蟹基因組DNA的高效提取方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410292771.2
• 申請(qǐng)日: 2014-06-27
• 公開（公告）號(hào): CN104031909A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王成輝;吳廉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海海洋大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 北京知本村知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 11039
• 代理人: 劉江良

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種簡便、快速、高質(zhì)量提取酒精保存后的河蟹基因組DNA的方法。

背景技術(shù)

河蟹是我國淡水絨螯蟹的總稱，包括中華絨螯蟹（Eriocheir?sinensis）、日本絨螯蟹（Eriocheir?japanicus）和合浦絨螯蟹（Eriocheir?hepunensis）。它們均屬節(jié)肢動(dòng)物門（Arthropoda）、甲殼綱（Crustacca）、十足目（Decapo）、方蟹科（Grapsidae）、絨螯蟹屬（Eriocheir）。中華絨螯蟹，是我國特有的水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，廣泛分布于遼河、長江、甌江、閩江等水系，此外在歐洲等地也有了廣闊分布。日本絨螯蟹主要分布于日本本土、朝鮮半島、俄羅斯的海參威等地區(qū)。合浦絨螯蟹分布于我國廣西南流江水系（如合浦縣）和珠江水系。在學(xué)術(shù)上，這三種絨螯蟹的分類地位與遺傳進(jìn)化關(guān)系長期以來為爭論焦點(diǎn)之一。在養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)上，這三種絨螯蟹常發(fā)生不同程度的苗種交流與種源混雜。因而，在學(xué)術(shù)與產(chǎn)業(yè)界均要對(duì)這幾種絨螯蟹進(jìn)行遺傳鑒別與種質(zhì)區(qū)分，需經(jīng)常用到其DNA進(jìn)行遺傳分析。

然而，針對(duì)河蟹種質(zhì)資源相關(guān)研究中，獲得良好實(shí)驗(yàn)材料DNA樣本是遺傳分析最為關(guān)鍵的首要任務(wù)。實(shí)際工作中，動(dòng)物標(biāo)本采集離實(shí)驗(yàn)室較遠(yuǎn)，通常采用酒精作為一種長久保護(hù)核酸的試劑廣泛應(yīng)用在科學(xué)工作中。因?yàn)樗苡行У臐B入到細(xì)胞中，從取材到提取過程中均能抑制DNA酶活性。酒精固定的樣本，避免了組織腐爛，但易使DNA碎片化。相對(duì)河蟹標(biāo)本而言，我們常常也是采用酒精進(jìn)行保存。與其它用酒精保存的水產(chǎn)生物相比較，河蟹屬于低等甲殼動(dòng)物的特殊性，甲殼對(duì)肌肉組織有一定保護(hù)作用，造成酒精滲入肌肉組織的過程較為緩慢，而使肌肉組織在較短時(shí)間內(nèi)得不到保存而存在一定程度的腐敗，影響了DNA的保存完整性，最后造成后續(xù)DNA提取困難。此外，發(fā)明申請(qǐng)人在近10年的研究過程中，發(fā)現(xiàn)酒精保存的河蟹組織樣本在提取DNA過程中的難度遠(yuǎn)高于魚類等其它水產(chǎn)生物。因而，發(fā)明一種酒精長期保存后的河蟹DNA提取方法對(duì)我們的科學(xué)研究工作具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種酒精保存后的河蟹DNA的高效提取方法，是本發(fā)明人在實(shí)踐中探索出的穩(wěn)定技術(shù)，解決了酒精長期保存后的中華絨螯蟹DNA提取難題，通過該方法能保障酒精保存后的河蟹提取的DNA數(shù)量足、質(zhì)量高，可用于后續(xù)相關(guān)種質(zhì)研究與遺傳分析，可滿足分子生物學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)DNA樣本的需求。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：一種提取酒精長期保存后河蟹基因組的DNA方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）剪取肌肉組織；

（2）提取基因組DNA，步驟如下；

a.?????????將第（1）步剪取的河蟹肌肉置烘箱烘干酒精；將肌肉組織剪碎，再加裂解緩沖液和蛋白酶K進(jìn)行消化，其中裂解緩沖液和蛋白酶K的成分和濃度為：含10mmol/L?EDTA，0.1mol/LNaCl，0.01M?Tris-Cl的STE緩沖液，10%?SDS，20mg/mL的蛋白酶K；河蟹肌肉用量與加裂解緩沖液和蛋白酶K的量之間的關(guān)系是：河蟹肌肉10-30mg，加300-500μL?STE，50-150μL?SDS和10-30μL蛋白酶K，于50-60℃的水浴鍋中消化，直至組織消化完全溶液變得清亮透明為止；

b.????????將步驟a得到的消化液離心，取上清液加飽和NaCl溶液輕混勻；

c.?????????再加氯仿顛倒輕混勻；

d.????????離心，取上清液再次加入氯仿；

e.?????????離心，取上清液加入異丙醇；

f.??????????離心沉淀DNA；

g.?????????洗滌DNA，輕搖混勻；

h.?????????離心，將沉淀DNA烘干；

i.???????????在烘干后的DNA加去離子水或TE溶液，并加入RNA酶去除DNA中的RNA，保存?zhèn)溆谩?/p>

優(yōu)選地：

在第（1）步中，在剪取河蟹第二步足上的肌肉的過程中縱向剪取肌肉，烘干酒精后然后用小剪刀將組織剪碎成粉末狀。

在第（2）步中，消化時(shí)間20至30小時(shí)，需將肌肉組織消化完全至溶液清亮透明。

在第（2）步中，河蟹肌肉用量與加裂解緩沖液和蛋白酶K的量之間的關(guān)系是：河蟹肌肉20mg，加400μL?STE，100μL?SDS和20μL蛋白酶K。

在第（2）步中，水浴的溫度為56℃。