[發明專利]一種實時熒光RT-PCR檢測人星狀病毒和諾如病毒的探針、引物、試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201410291136.2
• 申請日: 2014-06-25
• 公開（公告）號: CN104017905A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 施前鋒
• 申請（專利權）人: 長興縣人民醫院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京修典盛世知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11424
• 代理人: 楊方成;宋海龍

技術領域

本發明屬于基因檢測領域，涉及一種同時檢測人星狀病毒和諾如病毒的實時熒光RT-PCR檢測探針及其引物，以及所述的探針及引物在制備檢測人星狀病毒和諾如病毒的試劑盒中的應用。

背景技術

小兒腹瀉是世界行的常見病，嚴重危害兒童的身體健康和生命安全。據世界衛生組織統計，每年有超過一千萬小于5歲的兒童夭亡，而由于腹瀉引起的死亡占18％。另有文獻報道每年約有2百萬幼兒因腹瀉及其并發癥死亡，發展中國家死亡率大于發達國家，而其中約85％死亡病例來源于世界上的欠發達國家。引起小兒腹瀉的常見病原超過20種，但病毒性腹瀉較為常見，也越來越受到臨床工作者的重視。急性小兒腹瀉的常見病原體有人輪狀病毒(Human?Rotavirus,HRV)、腸道腺病毒(EntericAdenovirus,90EAdV)、人杯狀病毒(Human?Caliciviruses,HuCV)、星狀病毒(Astrovirus,AstV)與諾如病毒(Norovirus，NV)等。

人星狀病毒是由Madeley在1975年首次在電鏡下觀察到的病毒，根據宿主的不同可以分為哺乳動物屬和禽類屬。1997年，Noel等將星狀病毒分為7個基因型，發現其與血清型的劃分一致，隨后各地又報道了血清型8的發現。星狀病毒屬于單股正鏈RNA病毒，基因組從5’端到3’端包括一個85nt的5’非編碼區，3個開放閱讀框(ORF1a、ORF1b、ORF2)，1個約80nt的3’非編碼區以及一個30nt的poly?A尾巴。其中ORF1a和ORF1b編碼非結構蛋白，分別是絲氨酸蛋白酶和RNA依賴的RNA聚合酶，ORF2編碼衣殼蛋白。目前現有技術中檢測星狀病毒的方法主要為電鏡檢測、逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測、基因芯片檢測、核酸序列依賴擴增技術(nucleic?acid?sequence?based?amplification,NASBA)檢測。其中，實時熒光定量PCR方法具有靈敏度高、操作簡易，是臨床常規選擇的檢測方法。

諾如病毒是1968年在美國俄亥俄州諾瓦克地區的一所學校中暴發的一起流行性腹瀉的患者糞便中發現的，因此而得名，是首個被確認為引起人類急性胃腸炎的病毒。近年來隨著對諾如病毒分子生物學研究的進展?，F在人們認為諾如病毒是造成胃腸炎流行的首要原因，也是兒童和成人散發性胃腸炎的重要原因。常年都有諾如病毒感染病例發生，發病高峰為秋冬季，可通過食物、水源、接觸等多種途徑傳播，因而在一些公共場所如醫院、學校、軍隊中引起大規模爆發，人群危害較大。

諾如病毒是一個單股正鏈無包膜RNA病毒。屬于人杯狀病毒科，諾如病毒屬在電鏡下是有結構的小圓病毒，直徑26～35nm，呈二十面體對稱，外殼是由180個同一種外殼蛋白組成的90個二聚體構成。整個基因組分為三個開放閱讀框，其中ORF1編碼非結構蛋白(一個約200kD的多蛋白，被病毒編碼蛋白酶切割后產生病毒復制必需的RNA多聚酶蛋白，ORF1編碼包括保守的具有RNA多聚酶在內的非結構蛋白)；ORF2和ORF3編碼結構蛋白：ORF2編碼57kD的主要結構蛋白VP1；ORF3編碼一個22kD的小結構蛋白。根據諾如病毒RNA多聚酶區和衣殼區的核酸序列，將NoV分為5個基因組:G?I，GⅡ，GⅢ,GⅣ,GⅤ，其中根據ORF2全基因組序列，GI可分為14個基因型，GⅡ可分為19個基因型，其中我國主要感染的是GⅡ1，GⅡ3，GⅡ4。現有技術中常用的檢測諾如病毒的方法是電鏡法、普通RT-PCR方法、多重RT-PCR檢測以及ELISA技術。

現有技術中，已經有多種檢測星狀病毒以及諾如病毒的方法，以及可以同時檢測雙重熒光定量一步RT-PCR法同時檢測G?I，GⅡ型諾如病毒。但是，現有技術中并未有同時檢測星狀病毒和諾如病毒的檢測方法，本發明的目的即為克服現有技術中的缺陷，即通過一步RT-PCR方法檢測待測樣本中是否存在星狀病毒或諾如病毒，以此來提高檢測效率，節約檢測成本。

發明內容

本發明的原理在于針對星狀病毒和諾如病毒的穩定保守區域設計特異性引物，并針對序列對比同源性較高區域設計共用探針，然后通過實施定量RT-PCR檢測待測樣本中是否存在星狀病毒或諾如病毒。