[發明專利]一種實時熒光RT-PCR檢測人星狀病毒和諾如病毒的探針、引物、試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201410291136.2
• 申請日: 2014-06-25
• 公開（公告）號: CN104017905A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 施前鋒
• 申請（專利權）人: 長興縣人民醫院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京修典盛世知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11424
• 代理人: 楊方成;宋海龍

1.一種利用RT-PCR方法檢測星狀病毒(Astrovirus)和諾如病毒(Norovirus)的通用探針，其序列為FAM-TTTCAMCCWTYTGAGGSCCCTGCCCCMAT-TAMRA，其中M、W、Y、S為通用堿基，其中代表A或C，W代表A或T，S代表G或C，Y代表C或T。

2.根據權利要求1所述的探針，其中FLUO代表熒光報告基團，所述的熒光報告基團和淬滅基團選自本領域常規選用的熒光基團和淬滅基團，優選的為FAM,TET,JOE,HEX,VIC，更優選的為FAM,TET，其中最優選的為FAM；QUEN代表熒光淬滅基團，所述的熒光淬滅基團可以選自本領域常規選擇的淬滅基團，優選的為TAMRA,DABCYL,BHQ，更優選的為TAMRA，BHQ,最優選為TAMRA。

3.一種擴增人星狀病毒的引物對，所述的引物的序列為上游引物為AstV-F5’-CCATGCAGGGTTTCACTTCT-3’，下游引物為AstV-R5’-GATGGCATACACATCAGCTT-3’。

4.一種擴增諾如病毒的引物對，所述的引物的序列為上游引物為NoV-F5’-TAAGAGGGACCTCCAATGGC-3’,下游引物為NoV-R5’-GAATGGCCAAACTGTGTCAT-3’。

5.一種檢測星狀病毒和諾如病毒的試劑盒，所述的試劑盒包括權利要求1-2任一項所述的通用探針。

6.根據權利要求5所述的試劑盒，所述的試劑盒還包括權利要求3和4所述的引物對。

7.根據權利要求5或6所述的試劑盒，其中還包括所述的試劑盒包括RT-PCR反應液、陰性質控液，人星狀病毒和諾如病毒的陽性質控品。

8.一種非診斷性的檢測人星狀病毒和諾如病毒的方法，所述的方法包括如下步驟：

1)提取待測樣本中的RNA；

2)逆轉錄獲得cDNA模板；

3)利用權利要求3和4所述的引物對擴增cDNA模板，獲得特異性片段；

4)將步驟3)所得的特異性片段連接入T載體，并轉化感受態細胞，經抗生素篩選、測序獲得正確連接的標準質粒；

5)利用權利要求1或2所述的探針以及權利要求3和4所述的引物利用實時熒光定量PCR的方法檢測步驟4)制備的標準質粒，獲得標準曲線，其中設置10⁷,10⁶,10⁵,10⁴,10³,10²,10¹,10⁰濃度梯度；

6)選取待測樣本，利用步驟5)所述的實時熒光定量PCR方法檢測，每個樣本設置三個重復；

7)對比待測樣本的溶解曲線與標準曲線，獲得待測樣板中人星狀病毒和諾如病毒的拷貝數。