[發明專利]一種用于檢測醋酸格拉替雷樣本的UPLC方法

有效

• 申請號: 201410290469.3
• 申請日: 2014-06-24
• 公開（公告）號: CN105218646B
• 公開（公告）日: 2018-09-21
• 發明（設計）人: 唐洋明;李國弢;馬亞平;袁建成
• 申請（專利權）人: 深圳翰宇藥業股份有限公司
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;G01N30/02
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所 11430
• 代理人: 郎堅;唐寧

本發明提供一組與醋酸格拉替雷(共聚物?1)結構相似的內標肽作為共聚物?1分子量測定用內標以及與其配套使用的UPLC檢測及分離參數，使用方法能夠在高分辨的UPLC分離技術下，更準確的測定目標聚合物的分子量及分子量分布。

技術領域

本發明涉及一種用于檢測醋酸格拉替雷樣本的超高效液相色譜色譜(UltraPerformance Liquid Chromatography，UPLC)方法及與其配套使用的內標肽組。

背景技術

自身免疫類疾病(autoimmune diseases)是指，生物機體的免疫系統將一些機體本身的組織當作“外來物”進行攻擊的現象。通常這種疾病可以通過阻礙生物機體T細胞和B細胞對機體自身組織的反應，得到緩解。這些早期的免疫反應是通過抗原結合到MHC分子上促進的，并通過T細胞表達出來。自身免疫類疾病就是機體本身的組織和蛋白質被當作“自抗原”，被機體免疫系統攻擊。例如：多發性硬化癥，就是免疫系統對隔離和保護神經的髓鞘進行攻擊而導致的疾病，這種疾病發展到失去髓鞘，就會帶來神經元和運動神經功能喪失；其他例如系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎、自免疫性溶血性貧血等，也屬于此類疾病。

很多藥物開發出來用于治療自身免疫類疾病，包括多發性硬化癥。醋酸格拉替雷(又叫共聚物-1)是由丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸和酪氨酸通過聚合產生的不同分子量聚合物的混合物。它的四種氨基酸摩爾比大約是0.392～0.462:0.129～0.153:0.300～0.374:0.086～0.100(Ala：Glu：Lys：Tyr)，混合物中的共聚物的平均分子量大約5000～9000道爾頓。

為了能夠確保得到的共聚物-1具有藥效，就必須準確的知道多氨基酸混合物在合成過程中的平均分子量分布和變化，例如用Superose12色譜柱進行分析確定分子量，但是，由于對于不確定含量及分子量的聚合物混合物而言，由于沒有標準對照物，因此，進行分子量檢測時，多使用內標法進行評價，此時，質量合乎標準的內標物質對于檢測結果的準確性至關重要。

對于共聚物-1的內標物，上世紀末，US6514938記載了使用合成的多肽作為內標物調整色譜柱的校正系數，能夠較為準確測量共聚物-1平均分子量。但是，隨著分離技術的不斷發展，尤其是如高分辨的UPLC色譜(Ultra Performance Liquid Chromatography，超高效液相色譜)技術的不斷成熟，該方法專屬性不強的缺點就被暴露出來，在如UPLC的相對嚴格的條件下，需要對該方法進行修正，從而更準確的檢測目標聚合物的分子量及分子量分布，以便為相關的藥物質量控制提供更為準確的參考。

發明內容

本發明提供一組與目標化合物(共聚物-1)結構相似的內標肽作為共聚物-1分子量測定用內標以及與其配套使用的UPLC檢測及分離參數，使用該內標能夠在高分辨的UPLC分離技術時，更準確的測定目標聚合物的分子量及分子量分布。為相關研究提供更為真實的數據支持。

本發明首先涉及一種用來檢測共聚物-1的UPLC方法，該方法使用BEH125SEC色譜柱與BEH200SEC兩根色譜柱任意串聯的UPLC系統，柱參數為1.7um，4.6×150mm；使用pH值3.0-5.0(優選為3.5)、濃度0.1-0.5mol/l(優選為0.25)的甲酸銨或乙酸銨作為緩沖液；將所述緩沖液與乙腈按照緩沖液：乙腈＝1:9配制流動相；所述流動相通過過濾法除菌除雜。

本發明所述的UPLC方法中，繪制內標肽校準曲線和檢測目標共聚物-1時的方法參數還包括，本發明所述的串聯色譜柱系統的進樣和檢測樣本時，柱溫控制在30-60℃，優選為50℃；根據所述的串聯系統，制備標準曲線時內標肽組的進樣量為1-20ul，樣品濃度0.01～0.1mg/ml，優選為0.05mg/ml；根據所述的串聯系統，檢測目標共聚物-1時，樣品的濃度為0.1-10mg/ml，優選為4mg/ml。

本發明所述的UPLC方法中，所使用的內標肽組合共包含7條內標肽，所述的內標肽序列見表1