[發明專利]一種耐高溫產聚羥基丁酸酯細菌

無效

• 申請號: 201410287511.6
• 申請日: 2014-06-25
• 公開（公告）號: CN104120098A
• 公開（公告）日: 2014-10-29
• 發明（設計）人: 陸祖軍;黃愛民;夏櫻花;李云飛;江紹鋒;梁士楚
• 申請（專利權）人: 廣西師范大學;桂林民華科技發展有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/085
• 代理公司: 桂林市華杰專利商標事務所有限責任公司 45112
• 代理人: 羅玉榮

技術領域

本發明涉及生物技術，具體是一種耐高溫產聚羥基丁酸酯細菌（PHB）。?

背景技術

聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxybutyrate，PHB)是一種細胞內聚酯,具有生物降解性，為生物可降解塑料的新型高分子材料。?

目前PHB的生產方法有微生物合成和轉基因植物合成；轉基因植物合成PHB降低生產成本尚未成功；利用微生物合成PHB的生產成本相對較高，主要是由于高的發酵底物價格及提取純化費用。?

工業上主要采用兩步法培養微生物（有氧/富氮和貧氧/貧氮）來獲得PHB，控制氧含量的方法為單純的氧濃度控制（主要是灌注純氮）在成本、設備、工藝上要求很高。?

發明內容

本發明的目的是要提供一種耐高溫、產聚羥基丁酸酯（PHB）多的細菌。?

本發明一種耐高溫產聚羥基丁酸酯細菌，屬蠟樣芽胞桿菌，革蘭氏陽性，于2014年5月3日保藏于中國典型培養物保藏中心（簡稱CCTCC，地址：中國·武漢·武漢大學），保藏號為CCTCC?NO：M?2014179。該菌株形態特征為：短桿狀，長1~1.5μm。?

本發明耐高溫產聚羥基丁酸酯細菌是采用梯度增溫分離方法篩選得到的，其篩選方法包括如下步驟：?

（1）采集土壤樣品：采集地表以下5cm處的土壤為樣品；

（2）樣品預處理：取上述土壤樣品裝入已滅菌并盛裝有無菌水的容器中，密封后劇烈震搖10min，靜置懸浮液，取上清液離心2min后，取上層菌液為菌懸液，備用；

（3）擴大培養：分別取菌懸液10μL接種于250mL?LB培養液中，置于37℃恒溫箱中培養震蕩72h，得擴大菌種培養液；

（4）逐級梯升溫階篩選：取10μL擴大菌種培養液接種于250mL?LB培養液中，按溫度逐級遞升進行培養，即后一溫階所用接種菌液取自前一溫階培養的菌液；

（5）選定耐高溫菌群：在培養溫度下，觀察接種菌液后的LB培養液，如出現渾濁，則判定該菌可在此溫度下生長，反之則排除；

（6）選定耐高溫菌株：取耐50℃以上的菌液，以生理鹽水稀釋（10^-6），并均勻涂布于富氮培養基內，37℃培養48h；挑取有不同形態特征的單菌落，于37℃富氮培養基上分別擴繁后，以完全營養液體培養基加20%甘油混勻，于-80℃條件下保存；

（7）采用尼羅藍染色法，分別取耐50℃以上具不同形態特征的單菌落，接種于LB培養基培養12h；步驟（6）的耐高溫菌株經適當擴繁后稀釋（10^-6）涂布篩選培養基，于30℃條件下培養36h后，在365nm紫外燈照射下呈橘粉色菌落，即產PHB高的菌株，目標菌株再以富氮培養基37℃擴繁后，以完全營養液體培養基加20%甘油混勻，于-80℃條件下保存，得耐高溫、產PHB高的菌群。

步驟（3）所述的培養震蕩的震蕩頻率為100r/min。?

所述富氮培養基由酵母浸粉10g/L，蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，硫酸銨5g/L加蒸餾水定容至1L制成。?

經檢測，該耐高溫產PHB細菌可以耐受60℃的高溫，且產PHB的產率高，，且最適生長溫度為55℃，其合成PHB的最高產率為2.276g/L，最適生長pH值為7-7.5。?

本發明的優點是：由于該耐高溫產PHB細菌可以耐受60℃的高溫，因而可以很方便地通過控制溫度進而控制氧濃度，降低生產工藝和設備要求；可以在很簡單的發酵設備（如無防雜菌污染裝置）中，利用高有機質含量的蔗糖、木薯工業廢水作為碳源生長和合成PHB，降低設備投入及發酵底物成本；還可以通過提高溫度殺死其他非耐高溫細菌，從而保證目標菌體單一性，并提高其生物量和所提取的PHB純度。?

附圖說明

圖1為GXNUHT-PHB-1菌落自然光下形態圖；?

圖2為GXNUHT-PHB-1菌落尼羅藍染色自然光下形態圖；

圖3為GXNUHT-PHB-1菌落尼羅藍染色紫外光下形態圖；

圖4為GXNUHT-PHB-1革蘭氏染色顯微鏡觀察圖；

圖5為基于16S?rRNA基因序列以Neighbor-Joining法構建的系統發育樹；

圖6為GXNUHT-PHB-1胞內PHB的紅外光譜圖；

圖7為GXNUHT-PHB-1產物的1H-NMR圖；

圖8為GXNUHT-PHB-1產物的1C-NMR圖。

具體實施方式