[發明專利]一種分離純化大鼠肺微血管內皮細胞的方法

在審

• 申請號: 201410285772.4
• 申請日: 2014-06-25
• 公開（公告）號: CN104371968A
• 公開（公告）日: 2015-02-25
• 發明（設計）人: 張濤;姜代勛;穆祥
• 申請（專利權）人: 北京農學院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種從大鼠肺組織中分離提取高純度微血管內皮細胞的方法。?

背景技術

微血管內皮細胞位于微血管內表面，是營養物質、致病因子、細胞因子和藥物等由血液循環系統進入血管外組織的必經屏障，功能具有多樣性，是凝血、充血、瘀血、水腫、炎癥、免疫、腫瘤發生等基本病理變化的關鍵調節點。微血管內皮細胞的體外培養為深入了解其生物學特性提供了重要途徑，對研究開發保護和治療微血管內皮細胞功能障礙所致疾的途徑和藥物病具有重要意義。?

不同組織器官的微血管內皮細胞表型和功能有顯著異質性，某一臟器相關生理病理機制的研究需要培養相應的微血管內皮細胞。盡管當前已有多種動物心、肺、皮膚、腦等組織器官微血管內皮細胞體外培養的報道，但由于微血管的管徑小、分散于組織器官內部，不能直接灌注消化液或有效分離出微血管段，微血管內皮細胞的分離純化技術仍是個難題，難以避免非微血管內皮細胞的污染。?

肺微血管內皮細胞的體外培養當前主要采取酶消化法和組織貼塊法，酶消化法易于短期內獲得大量微血管內皮細胞，但非微血管內皮細胞會均勻混雜其中，單純的手工操作難以進行純化；組織貼塊法也因組織樣品和處理方法的差異無法確定最佳的去塊時間，難以避免肺微血管內皮細胞的游出而污染。?

本發明將酶消化法和免疫磁珠技術相結合，可快速從大鼠肺組織中分離、純化到高純度的微血管內皮細胞。?

發明內容

本發明的目的是提供一種分離培養高純度大鼠肺微血管內皮細胞的方法。?

本發明的目的是通過以下技術方案實現的。?

一種從大鼠肺組織分離培養高純度微血管內皮細胞的方法，其步驟如下。?

A.?將大乳鼠斷頸處死，剖開胸腔，右心室灌注Hank’s液，無菌取出肺臟，剔除臟胸膜，剪取肺邊緣組織，去除大血管，剪碎為小塊；所述右心室灌注Hank’s液于4oC預冷，灌注至肺臟發白；所述剪碎為小塊的體積約為1?mm³。?

B.?將所述肺組織小塊用Hank’s液漂洗，加入消化液中消化；所述的消化液為0.2%膠原酶?和0.1%中性蛋白酶混合溶液，消化溫度為37oC，消化時間為20~30?min。將所述消化后的溶液過200目細胞篩，收集濾液離心，沉淀細胞團用0.01?M?PBS重懸為單細胞懸液；所述離心處理，轉速為800~1200?rpm，時間為5~10?min；所述0.01?M?PBS含有0.1%?牛血清白蛋白、2?mM?EDTA；所述的單細胞懸液密度為1×10⁷個/mL。?

C.?將所述的單細胞懸液中加入CD31免疫磁珠，孵育得到細胞-抗體-磁珠復合物。所述的CD31免疫磁珠為CD31單克隆抗體與磁珠孵育結合獲得，溫度為4oC，時間為過夜，密度為4×10⁸個/mL，每毫升單細胞懸液加CD31免疫磁珠25?μL；所述的孵育處理，置于旋轉搖床，溫度為15~25?oC，時間為30~60?min。?

D.?將所述的細胞-抗體-磁珠復合物從未結合磁珠和細胞中分離；所述的分離處理使用KingFisher?96磁珠分選純化系統，程序設置為：慢速混合30?s，收集2次，每次5?s；重復4次，細胞-抗體-磁珠復合物釋放于含5%胎牛血清、1?mM氯化鈣和4?mM氯化鎂的DMEM培養基。?

E.?將所述的細胞-抗體-磁珠復合物懸浮液中加入釋放緩沖液去除細胞表面結合的磁珠；所述釋放緩沖液為DNase?溶液，每毫升細胞懸液加4?μL，溫度為室溫，作用時間為10~20?min；所述去除磁珠用KingFisher?96磁珠分選純化系統，程序設置為：中速混合1?min，收集2次、每次1?s，中速釋放3?s；重復1次。?

F.?將所述去除磁珠的CD31+細胞離心，用完全培養基重懸，接種孵育培養；所述的離心處理，轉速為800~1200?rpm，時間為5~10?min；所述的完全培養基為DMEM培養基，含20%胎牛血清、2?mM?L-谷氨酰胺、100?IU青霉素和100?μg/mL鏈霉素；所述的接種培養細胞密度為1×10⁵個/mL。?

G.?所述的接種培養細胞每3天換一次完全培養基，至亞匯合狀態時傳代培養；所述的傳代培養用含0.05%胰蛋白酶和0.005%?EDTA的0.01?M?PBS溶液消化脫壁，傳代密度為1×10⁵個/mL。?

具體實施方式

實施例一。?

1.?主要實驗材料。?

（1）實驗動物：7日齡SD大乳鼠。?