[發(fā)明專利]一種分離純化大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410285772.4
• 申請(qǐng)日: 2014-06-25
• 公開（公告）號(hào): CN104371968A
• 公開（公告）日: 2015-02-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張濤;姜代勛;穆祥
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京農(nóng)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種從大鼠肺組織中分離、純化微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法，其特征在于：所述的方法主要涉及動(dòng)物肺組織的單細(xì)胞懸液的制備和CD31+細(xì)胞的免疫磁珠分選，與傳統(tǒng)肺組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離純化方法比較具有純度高的特點(diǎn)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從動(dòng)物肺組織中分離、純化微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法，其特征在于該方法包括以下步驟：

A.?將大乳鼠斷頸處死，剖開胸腔，右心室灌注Hank’s液，無菌取出肺臟，剔除臟胸膜，剪取肺邊緣組織，去除大血管，剪碎為小塊；所述右心室灌注Hank’s液于4oC預(yù)冷，灌注至肺臟發(fā)白；所述剪碎為小塊的體積約為1?mm³；

B.?將所述肺組織小塊用Hank’s液漂洗，加入消化液中消化；所述的消化液為0.2%膠原酶????????????????????????????????????????????????和0.1%中性蛋白酶混合溶液，消化溫度為37oC，消化時(shí)間為20~30?min；

將所述消化后的溶液過200目細(xì)胞篩，收集濾液離心，沉淀細(xì)胞團(tuán)用0.01?M?PBS重懸為單細(xì)胞懸液；所述離心處理，轉(zhuǎn)速為800~1200?rpm，時(shí)間為5~10?min；所述0.01?M?PBS含有0.1%?牛血清白蛋白、2?mM?EDTA；所述的單細(xì)胞懸液密度為1×10⁷個(gè)/mL；

C.?將所述的單細(xì)胞懸液中加入CD31免疫磁珠，孵育得到細(xì)胞-抗體-磁珠復(fù)合物；

所述的CD31免疫磁珠為CD31單克隆抗體與磁珠孵育結(jié)合獲得，溫度為4oC，時(shí)間為過夜，密度為4×10⁸個(gè)/mL，每毫升單細(xì)胞懸液加CD31免疫磁珠25?μL；所述的孵育處理，置于旋轉(zhuǎn)搖床，溫度為15~25oC，時(shí)間為30~60?min；

D.?將所述的細(xì)胞-抗體-磁珠復(fù)合物從未結(jié)合磁珠和細(xì)胞中分離；所述的分離處理使用KingFisher?96磁珠分選純化系統(tǒng)，程序設(shè)置為：慢速混合30?s，收集2次，每次5?s；重復(fù)4次，細(xì)胞-抗體-磁珠復(fù)合物釋放于含5%胎牛血清、1?mM氯化鈣和4?mM氯化鎂的DMEM培養(yǎng)基；

E.?將所述的細(xì)胞-抗體-磁珠復(fù)合物懸浮液中加入釋放緩沖液去除細(xì)胞表面結(jié)合的磁珠；所述釋放緩沖液為DNase?溶液，每毫升細(xì)胞懸液加4?μL，溫度為室溫，作用時(shí)間為10~20?min；所述去除磁珠用KingFisher?96磁珠分選純化系統(tǒng)，程序設(shè)置為：中速混合1?min，收集2次、每次1?s，中速釋放3?s；重復(fù)1次；

F.?將所述去除磁珠的CD31+細(xì)胞離心，用完全培養(yǎng)基重懸，接種孵育培養(yǎng)；所述的離心處理，轉(zhuǎn)速為800~1200?rpm，時(shí)間為5~10?min；所述的完全培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，含20%胎牛血清、2?mM?L-谷氨酰胺、100?IU青霉素和100?μg/mL鏈霉素；所述的接種培養(yǎng)細(xì)胞密度為1×10⁵個(gè)/mL；

G.?所述的接種培養(yǎng)細(xì)胞每3天換一次完全培養(yǎng)基，至亞匯合狀態(tài)時(shí)傳代培養(yǎng)；所述的傳代培養(yǎng)用含0.05%胰蛋白酶和0.005%?EDTA的0.01?M?PBS溶液消化脫壁，傳代密度為1×10⁵個(gè)/mL。