[發明專利]鴨坦布蘇病毒感染性克隆毒株及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201410283527.X
• 申請日: 2014-06-23
• 公開（公告）號: CN104673758A
• 公開（公告）日: 2015-06-03
• 發明（設計）人: 李澤君;石迎;閆麗萍
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院上海獸醫研究所
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/86;C12N15/34;C12N15/41;A61K39/12;A61P31/20;C12R1/93
• 代理公司: 上海序倫律師事務所 31276
• 代理人: 周東萍

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種鴨坦布蘇病毒感染性克隆毒株及其制備方法和應用。?

背景技術

鴨坦布蘇病毒(Duck?Tembusu?virus，DTMUV)是一種可引起鴨產蛋下降、生長遲緩和死亡的黃病毒。2010年春季以來，上海市、江蘇省、浙江省、安徽省等地相繼爆發一種導致蛋鴨減產、肉鴨生長遲緩和死亡的一種新發病，研究證明引起該病的病原為坦布蘇病毒(Tembusu?virus)。該病毒對蛋鴨和肉鴨均有致病力，病鴨主要表現為高熱、運動障礙、食欲下降甚至廢絕、產蛋下降甚至停止，嚴重可導致死亡，死亡率可達5％-10％。據報道鴨坦布蘇病毒病造成的經濟損失已超過50億元。?

鴨坦布蘇病毒病在中國大陸首次發生，該病具有高度傳染性，并且一年四季都可流行，給鴨坦布蘇病毒病的防控帶來了極大的困難，目前預防該病最有效的方法是疫苗免疫。但是，目前仍缺乏高效安全的防控鴨坦布蘇病毒病的疫苗。?

發明內容

本發明要解決目前缺乏高效安全的防控鴨坦布蘇病毒病疫苗的技術問題，提供一種鴨坦布蘇病毒感染性克隆毒株，該鴨坦布蘇病毒感染性克隆毒株是利用反向遺傳操作技術獲得的鴨坦布蘇病毒強毒株FX2010的感染性克隆毒株，其不僅能用于研制新型鴨坦布蘇病毒病疫苗，而且能用作病毒載體表達外源基因。?

此外，還需要提供一種上述鴨坦布蘇病毒感染性克隆毒株的制備方法和應用。?

為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現:?

在本發明的一個方面，提供了一種鴨坦布蘇病毒感染性克隆毒株，該感染性克隆毒株是親本毒鴨坦布蘇病毒強毒株FX2010的克隆毒株，其具有SEQ?ID?NO.1所示的全基因序列，該感染性克隆毒株是通過反向遺傳操作方法制得。?

優選的，所述反向遺傳操作方法包括以下步驟：?

通過分段擴增、分段克隆、以及融合PCR，獲得含有轉錄啟動子序列的鴨坦布蘇病毒強毒株FX2010的全長cDNA；?

將所述cDNA經體外轉錄獲得RNA，再將該RNA轉染細胞并從細胞上救獲鴨坦布蘇病毒強毒株FX2010的感染性克隆毒株。?

優選的，所述轉錄啟動子為T7啟動子。?

在本發明的另一方面，提供了一種重組載體，包含以下鴨坦布蘇病毒強毒株FX2010全基因組序列中的部分核酸片段：SEQ?ID?NO.1序列中第3656-6353位核酸片段、第6216-9775位核酸片段、第9753-10991位核酸片段、第3656-9775位核酸片段、或第3656-10991位核酸片段。?

在本發明的另一方面，還提供了一種核酸分子，包括SEQ?ID?NO.1所示鴨坦布蘇病毒強毒株FX2010全基因組序列的第1-1512位核酸片段、第1397-2896位核酸片段、第2643-4020位核酸片段、或SEQ?ID?NO.1序列5’端還加設有轉錄啟動子的全基因序列。?

在本發明的另一方面，還提供了一種鴨坦布蘇病毒感染性克隆毒株的制備方法，包括以下步驟：?

分段擴增鴨坦布蘇病毒全基因組的各DNA片段；?

將部分DNA片段分別克隆至載體，然后經亞克隆獲得含有覆蓋鴨坦布蘇病毒基因組第3656-10991位核酸序列的重組載體；?

通過融合PCR獲得含有轉錄啟動子序列的鴨坦布蘇病毒的全長cDNA；?

將所述cDNA經體外轉錄獲得RNA，再將該RNA轉染細胞并從細胞上救獲鴨坦布蘇病毒的感染性克隆毒株。?

在本發明的另一方面，還提供了一種上述鴨坦布蘇病毒感染性克隆毒株在制備預防或治療鴨坦布蘇病毒病的疫苗中的應用。?

在本發明的另一方面，還提供了一種上述鴨坦布蘇病毒感染性克隆毒株作為病毒載體的應用。?

在本發明的另一方面，還提供了一種重組鴨坦布蘇病毒，該重組病毒是將上述鴨坦布蘇病毒感染性克隆毒株的E基因替換為鴨坦布蘇病毒弱毒株的E基因而構建成的重組鴨坦布蘇病毒。?

本發明鴨坦布蘇病毒感染性克隆毒株，不僅能用于研制新型鴨坦布蘇病毒病疫苗，而且能用作病毒載體表達外源基因，同時還為進一步研究鴨坦布蘇病毒的基因組結構、功能、以及和病毒宿主相互作用機理提供重要的研究工具。?

附圖說明

下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步詳細的說明。?

圖1是本發明實施例1的FX2010株基因組全長cDNA構建策略示意圖；?