[發(fā)明專利]一種蠟樣芽孢桿菌及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410283436.6
• 申請(qǐng)日: 2014-06-23
• 公開（公告）號(hào): CN104017761A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 阮海華;張西軒;王素英;李曄
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津商業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12N9/54;C12P21/06;C12R1/085
• 代理公司: 天津市三利專利商標(biāo)代理有限公司 12107
• 代理人: 肖莉麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說是涉及一種蠟樣芽孢桿菌及其在降解膠原蛋白或明膠方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)

膠原酶的化學(xué)名為膠原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理pH和溫度條件下特異性地降解天然膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu)，而不損傷其它蛋白質(zhì)和組織。

膠原酶廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)以及工業(yè)生產(chǎn)上。例如，目前臨床上應(yīng)用最廣泛的藥用膠原酶是指從溶組織梭狀芽孢桿菌的發(fā)酵液中提取、純化并精制而得的白色或類白色無菌凍干粉針生物制劑。膠原酶可使創(chuàng)口邊緣膠原纖維降解，具有較好的清創(chuàng)作用，繼而促使肉芽生長，上皮化，加快傷口愈合且對(duì)正常血管和神經(jīng)組織無損傷作用。在臨床上主要用于嚴(yán)重(II-III度)燒傷的清創(chuàng)、脫痂和植皮，亦可用于皮膚潰瘍、褥瘡等，治療確切，安全可靠。此外，在工業(yè)方面，膠原酶也被廣泛的應(yīng)用于皮革工業(yè)的脫毛及軟化過程，代替了傳統(tǒng)的浸灰方法，既節(jié)省時(shí)間，又改善勞動(dòng)衛(wèi)生條件，且對(duì)環(huán)境危害小。同時(shí)，膠原酶還被廣泛應(yīng)用于蠶絲脫膠，肉類嫩化及酒類澄清等過程。

目前已研究的膠原酶以動(dòng)物基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)為主，細(xì)菌來源的膠原酶較少，最早研究的微生物來源膠原酶是溶組織梭狀芽孢桿菌膠原酶，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床。細(xì)菌來源膠原酶與動(dòng)物膠原酶不同之處主要在于：(1)底物種類不同：微生物膠原酶底物范圍更為廣泛，對(duì)動(dòng)物膠原酶不能降解的IV、V型膠原也能輕易降解；(2)裂解方式不同：一般微生物膠原酶可作用于膠原的多個(gè)位點(diǎn)，產(chǎn)生小分子短肽或氨基酸，而動(dòng)物膠原酶只作用于膠原N端3/4處Gly-Lue或Gly-Ile肽鍵，產(chǎn)生一個(gè)3/4片段和1/4片段，分別命名為TCA(Tropocollagen“A”fragment)和TCB(Tropocollagen“B”fragment)；(3)獲得的難易不同：微生物膠原酶絕大多數(shù)可分泌到胞外，通過發(fā)酵培養(yǎng)可大量獲得，而動(dòng)物膠原酶需要進(jìn)行組織培養(yǎng)和提取，較難獲得；(4)潛在的降解膠原能力不同：微生物膠原酶具有更高的降解活性。因而，微生物來源的膠原酶具有更廣的應(yīng)用價(jià)值。

目前，利用生物技術(shù)途徑篩選具有膠原酶活性的微生物已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。目前已發(fā)現(xiàn)的分泌膠原酶的微生物具有多樣性的特點(diǎn)，比如從深海到土壤，從需氧到厭氧，從細(xì)菌到真菌等等。

我國在微生物膠原酶方面的研究與應(yīng)用還處于剛起步階段，國內(nèi)市場依賴大量高價(jià)進(jìn)口膠原酶產(chǎn)品，限制了微生物膠原酶的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)缺陷，提供一種能夠同時(shí)分泌兩種分子量類型的膠原酶的蠟樣芽孢桿菌。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種蠟樣芽孢桿菌在生產(chǎn)膠原酶及降解膠原蛋白或明膠方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用蠟樣芽孢桿菌降解膠原蛋白或明膠的方法。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的所采用的技術(shù)方案是：

一種蠟樣芽孢桿菌，拉丁文名稱為Bacillus?cereus，其保藏編號(hào)為：CGMCC?NO.8614。

一種所述蠟樣芽孢桿菌在生產(chǎn)含有膠原酶的酶液方面的應(yīng)用，所得含有膠原酶的酶液中包含兩種分子量不同的膠原酶，即分子量為106kDa的膠原酶Ⅰ和分子量為95kDa的膠原酶Ⅱ。

一種所產(chǎn)含有膠原酶的酶液在降解膠原蛋白和明膠方面的應(yīng)用。

一種利用蠟樣芽孢桿菌降解膠原蛋白或明膠的方法，包括下述步驟：

(1)將權(quán)利要求1所述的蠟樣芽孢桿菌使用LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，然后離心除去菌體，得到粗酶液；在冰浴條件下向粗酶液中加入硫酸銨粉末，沉淀所得粗酶液中的蛋白，得到沉淀物；所得沉淀物用pH值為7.5的Tris-HCl緩沖液復(fù)溶，所得復(fù)溶溶液用pH值為7.5的Tris-HCl緩沖液在4℃條件下透析，透析后得到濃縮酶液；

(2)將含膠原蛋白和/或明膠的溶液與步驟(1)所得濃縮酶液混合后于37℃水浴條件下降解膠原蛋白和/或明膠。

所述含有膠原蛋白和/或明膠的溶液為魚鱗或魚皮或魚骨或牛骨或豬皮的提取液。

所述魚鱗的提取液通過下述方法得到：

(1)將干燥的魚鱗浸于HCl溶液中在室溫下攪拌脫鈣；再將脫鈣后的魚鱗浸于Na₂CO₃溶液中，在室溫條件下攪拌，使膠原蛋白中的膠原纖維的致密結(jié)構(gòu)變疏松；最后，用蒸餾水將魚鱗反復(fù)漂洗至中性；