[發明專利]一種用于制備肝細胞靶向轉遞小干擾RNA的方法

有效

• 申請號: 201410283413.5
• 申請日: 2014-06-23
• 公開（公告）號: CN104087574B
• 公開（公告）日: 2019-08-02
• 發明（設計）人: 武文斌;巴劍波;陳雙紅;郝蕙玲;孫錦程;徐雄利;呂鴻雁
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍海軍醫學研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/113
• 代理公司: 上海容慧專利代理事務所(普通合伙) 31287
• 代理人: 王裕

本發明屬于生命科學領域，具體涉及一種用于制備肝細胞靶向轉遞小干擾RNA的方法。本發明公開了一種用于制備肝細胞靶向轉遞小干擾RNA的方法，反應底物包括乳糖酸或半乳糖衍生物、末端氨基修飾RNAi多核苷酸和EDC，其中，乳糖酸或半乳糖衍生物作為耦合反應的羧基供體和靶向耦合物的半乳糖基供體，末端氨基標記RNAi多核苷酸作為耦合反應的伯氨基供體，EDC作為零長度交聯劑。本發明所公開的方法操作簡便、產率高、活性好，實現了小干擾RNA與肝細胞特異性配基―半乳糖基的共價耦合，耦合物被肝細胞特異性攝取后，表現出針對目標基因的沉默活性。

技術領域

本發明屬于生命科學領域，具體涉及一種用于制備肝細胞靶向轉遞小干擾RNA的方法。

背景技術

RNA干擾(RNAi)為由一類小干擾RNA分子介導的轉錄后基因沉默現象，廣泛應用于基因功能鑒定和基因治療研究領域。小干擾RNA分子通常是由19～23對堿基構成的雙鏈結構，分子量13～15kd，攜帶38～40個凈負電荷，因此小干擾RNA裸分子自身無法穿越負電荷細胞膜，常需要陽性脂質體包裹攜帶轉染細胞。此外，小干擾RNA系統使用時，其生物分布十分廣泛，在肝、腎、心、脾、腸等多臟器廣泛分布，造成靶組織內RNAi活性不足，補償性加量后易出現靶外基因沉默、免疫刺激和miRNA競爭抑制等副作用。因此，小干擾RNA藥物轉化的主要障礙在于缺乏理想的高效細胞靶向轉遞手段。

肝臟作為人體的重要代謝器官，易受病毒感染、代謝性疾病、腫瘤等的侵害。提高小干擾RNA裸分子靶向進入肝細胞是加快RNAi治療肝疾時藥物轉化的關鍵。目前，協助小干擾RNA肝細胞靶向轉遞媒介物大體可分為病毒載體和非病毒載體兩類。前者轉染效率高，其靶向性的實現可通過肝細胞特異性啟動子獲得，但免疫排斥反應和基因重組風險限制其臨床轉化。非載體類靶向轉遞可以借助陽離子復合物(脂質體或多聚體)或化學修飾等手段，將有肝細胞特異識別能力的配基以共價鍵或非共價鍵的方式與小干擾RNA結合得以實現。其中，非共價鍵結合是小干擾RNA肝細胞靶向轉遞研究的常見技術。

非共價鍵結合小干擾RNA靶向復合物優勢在于方法靈活多樣，不改變小干擾RNA分子結構，體外研究結果較為理想。如Oishi(2007年)將半乳糖化聚乙二醇和多聚賴氨酸形成非共價鍵復合體，依靠靜電攜帶小干擾RNA(顆粒直徑110nm)。體外示蹤表明復合物順利地轉入了Huh7細胞。再如，Kim(2007年)將脂質體、膽固醇、載脂蛋白apoA-Ⅰ靜電結合小干擾RNA，形成小干擾RNA非共價鍵復合物，體外轉遞肝細胞，其攝取量是無apoA-Ⅰ的3倍。Sato(2007年)利用半乳糖化膽固醇衍生物(C4-chol)與中性脂質體DOPE及小干擾RNA非共價鍵結合成75.3±5.8nm的復合物顆粒，體內實驗表明約80％的小干擾RNA復合物分布于肝實質細胞。

非共價靶向小干擾RNA復合物不足在于非共價鍵導致結構不穩定，易降解；直徑過大(＞50nm)，難以通過毛細血管壁，容易被肝Kupffer細胞清除；激活補體系統，易被網狀內皮系統清除；藥代指標不理想，藥物轉化空間不大。

配基與小干擾RNA依靠共價鍵結合后肝細胞轉遞的優勢明顯，形成的耦合物分子均質，可控性好，容易純化。配基化小干擾RNA單分子直徑小，容易通過肝血竇毛細血管壁，藥代學指標清晰。如，利用膽固醇主要在肝臟代謝的特點，Lorenz和Soutschek(2004年)將膽固醇與小干擾RNA正義鏈5’端共價耦合后發現，穩定性明顯提高(半衰期95min，血漿清除率0.5mL/min)。雖然其在心、肺、脂肪等多組織器官均有分布，但以肝臟和空腸攝取最多。再如，Rozema(2007年)以半乳糖胺為配基，將丁基-氨基-乙烯醚聚合物通過側鏈羧基二甲基酐鍵與聚乙二醇和N-乙酰半乳糖胺共價連接后，與小干擾RNA5’端二硫鍵共價結合，形成大小為10nm的單分子化合物。體外轉染證實其具有與陽性脂質體siQUEST相同的肝細胞轉染效率，可降低目標基因表達80％。體內主要分布在肝細胞，只少量被肝竇非實質細胞和腎、脾攝取。

配基與小干擾RNA共價鍵結合相關技術較少見諸報道，主要障礙在于耦聯反應條件要求較高，需要設計更為簡便、巧妙的中間橋聯分子。