[發明專利]一種篩選抗原不同結合位點的單克隆抗體的方法

有效

• 申請號: 201410283271.2
• 申請日: 2014-06-23
• 公開（公告）號: CN104020289A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 賴增祖;葉欣;徐健;賴曉娟;楊奎東
• 申請（專利權）人: 寧波艾科生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;C07K16/28
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 張鉑

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種篩選抗原不同結合位點的單克隆抗體的方法。

背景技術

1975年德國科學家Kohler和英國科學家Milstein利用雜交瘤技術將產生抗體的B淋巴細胞同骨髓瘤細胞融合，成功的建立了單克隆抗體制備技術。單克隆抗體技術的基本原理為：小鼠受到外界抗原刺激后可誘發免疫反應，產生相應的抗體，這一職能是由B淋巴細胞來承擔的；腫瘤細胞在體外培養的條件下可以無限傳代，是永久的細胞。把小鼠的骨髓瘤細胞與經免疫過的小鼠的脾細胞在聚乙二醇等介導下發生融合，融合后的雜交瘤細胞具有兩種親本細胞的特性，一方面可以分泌特定的抗體,另一方面也具備了腫瘤細胞無限增殖的能力,?可在體外培養條件下或移植到體內無限增殖,?從而分泌大量單克隆抗體。單克隆抗體的理化性狀高度均一，生物活性單一，與抗原結合的特異性強，便于人為處理和質量控制，并且可工廠化生產，來源容易。單克隆抗體用途廣泛，在生物學、醫學和其他研究領域中都顯示了極大的應用價值。在醫學領域中，單克隆抗體在疾病診斷、判斷預后、防治以及致病機制研究等方面起著巨大的促進作用。迄今全球已研制出數萬種單克隆抗體。

目前，多數血漿中的各種蛋白濃度的指標多使用夾心ELISA法測定，這種方法特異性好，敏感度高。夾心ELISA需要兩個結合同一個蛋白抗原但不同位點的單克隆抗體。制備兩個結合同一個蛋白抗原但不同位點的單克隆抗體的雜交瘤細胞株和制備單個單克隆抗體雜交瘤細胞株基本一樣,?但在獲得陽性克隆細胞株后,?要進行抗體之間抗原結合位點的檢測，?只有結合同一個蛋白抗原但不同位點的兩個單克隆抗體才可應用于夾心ELISA測定法的建立。制備單克隆抗體包括抗原制備、動物?免疫、建立抗體檢測方法、細胞融合、選擇雜交瘤、雜交瘤細胞的克隆化、凍存、穩定性測定以及單克隆抗體的大量生產等一系列復雜步驟，?一般要花費6個月以上的時間。獲得陽性克隆后，再檢測這些陽性單克隆抗體是否結合同一位點。傳統的方法是將所有的陽性單克隆雜交瘤細胞株進行培養生產抗體,?并將這些抗體分離純化出來，然后將純化后的陽性單克隆抗體用堿性磷酸酶標記。再利用抑制性ELISA的方法檢測這些陽性克隆單克隆抗體是否結合同一個位點。如果兩個陽性的單克隆抗體之間不能相互抑制，則說明這兩個抗體不結合到同一個位點，這樣這兩個抗體就可以配對建立夾心ELISA檢測方法。

在單克隆抗體的陽性克隆雜交瘤細胞株數量很多的情況下，使用傳統方法對黨克隆抗體之間抗原結合位點的檢測需要大量的工作量和時間。隨著越來越多的疾病相關指標的發現和臨床應用，對應用于ELISA的配對的單克隆抗體的需求越來越大，特別是ELISA微陣芯片技術的發展，對高質量的配對單克隆抗體的需求更是越來越多。利用ELISA微陣芯片技術，只需要一個血樣就可以同時測定成百上千的指標。大大降低了對血樣的采集和檢測的時間。因此夾心ELISA配對抗體的高通量篩選方法建立迫在眉睫。

發明內容

本發明針對現有技術不足，提供了一種簡便、高效、準確的高通量篩選抗原不同結合位點的單克隆抗體的方法。

本發明技術方案如下：

一種篩選抗原不同結合位點的單克隆抗體的篩選方法，包括如下步驟：

（1）將具有2個或2個以上抗原決定簇的抗原免疫小鼠，分離小鼠的脾臟細胞，并將小鼠脾臟細胞和小鼠骨髓瘤細胞SP2/0融合，進行選擇性培養，利用ELISA方法篩選出陽性克隆抗體雜交瘤細胞株，并分別將各個陽性克隆抗體雜交瘤細胞株進行克隆化培養獲得單克隆抗體雜交瘤細胞株，再將每株單克隆抗體雜交瘤細胞株進行培養，分別得到不同陽性單克隆抗體雜交瘤細胞的培養上清液；

（2）將步驟（1）得到的不同陽性單克隆抗體雜交瘤細胞株的培養上清液以兩兩組合的方式分別加入到共價交聯有蛋白A或G的膠乳顆粒的溶液中，孵育后加入抗原，?蛋白A或G可特異性結合抗體,?從而使得單克隆抗體濃縮吸附于膠乳顆粒表面,?如果加入的兩個單克隆抗體結合抗原的不同結合位點,?就會使得膠乳顆粒凝集,?從而光吸收度增加。如果加入的兩個單克隆抗體結合的抗原結合位點相同,?膠乳顆粒不會發生凝集,?光吸收度不會變化。?通過測定600nM的吸光度變化就可以確認兩個單克隆抗體的抗原結合位點是否相同。

??在本發明涉及的技術領域，具有2個或2個以上抗原決定簇的抗原均適應于本發明所述的篩選方法，如cTni,?BNP,?RBP,?LPPLA2,?PCT,?HbA1c,?纖溶酶原,?纖溶酶抑制劑或ST2。本發明的一個優選的方案中，使用的抗原為人ST2蛋白。