[發明專利]一種用于篩選微生物胞外膠原酶的酶譜方法

有效

• 申請號: 201410279995.X
• 申請日: 2014-06-23
• 公開（公告）號: CN104049026A
• 公開（公告）日: 2014-09-17
• 發明（設計）人: 阮海華;張西軒;王素英;李曄
• 申請（專利權）人: 天津商業大學
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447
• 代理公司: 天津市三利專利商標代理有限公司 12107
• 代理人: 肖莉麗

技術領域

本發明屬于生物蛋白酶檢測技術領域，具體涉及一種用于篩選微生物胞外膠原酶的酶譜方法。

背景技術

酶譜分析技術是在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳的基礎上發展而來的。酶譜分析技術是指使用含有底物蛋白的凝膠進行電泳或在電泳后將不含底物蛋白的凝膠浸泡在底物溶液中，再通過孵育、染色、脫色的方法顯示經酶作用后底物蛋白的染色情況的變化，進而對酶活性進行定性分析。

雖然酶譜分析的方法常被用來檢測蛋白酶類的活性，但現有酶譜技術仍然存在以下幾點技術缺陷：

(1)目前的酶譜技術是在聚丙烯酰胺凝膠上檢測到蛋白酶負染條帶在聚丙烯酰胺凝膠上的位置，但經常由于底物背景過深而導致不能直接顯示蛋白質Marker條帶，因此難以通過酶譜分析直接確定未知蛋白酶的分子量。

(2)目前的酶譜分析技術分析蛋白酶的分子量時，一般需要制備兩塊凝膠，一塊凝膠內配制了高濃度的底物蛋白，另一塊膠不包含底物蛋白而用來分析蛋白質量標準(Protein?Marker)；電泳結束后，含有底物蛋白的凝膠進行負染，而不含底物蛋白的凝膠直接進行考馬斯亮藍染色；染色結束后將兩塊膠進行比對，測定目標蛋白酶的分子量。但是凝膠中高濃度的底物蛋白會影響蛋白酶在膠中的遷移率，進而可能導致蛋白酶的分子量計算出現較大偏差。

(3)若采用將凝膠浸泡在底物溶液中的方法，容易導致蛋白酶的透明條帶分辨率低，條帶不夠集中而清晰。

(4)目前的酶譜分析中在凝膠孵育過程中常用NaN₃作為防腐劑以避免產酶微生物對結果的影響，效果雖然很好但NaN₃的毒性很強,存在一定的危險性。

膠原酶的化學名為膠原蛋白水解酶(Collagenase)，生理pH和溫度條件下膠原酶能夠特異性地降解天然膠原蛋白的三維螺旋結構，而其他蛋白酶類則不具備此功能。膠原酶可以廣泛應用于醫學、食品、化妝品等工業生產中。醫學研究中，常用膠原酶治療腰間盤突出癥、瘢痕疙瘩、血栓、潰瘍、膿瘡等疾病，它有不損傷胞膜及神經細胞且不破壞乳酪蛋白、血紅蛋白、硫酸角質素等蛋白質的優點,治療效果安全有效。工業應用中，常用膠原酶降解動物來源的膠原蛋白，其酶解產物易于被人體吸收與利用，添加至食品及化妝品中可改善人的體質及膚質。

膠原酶是一種底物特異性極高的蛋白酶，因為膠原酶與蛋白酶的底物完全不同，膠原酶具有較強的專一性，對其他類型蛋白水解能力差。目前的酶譜技術無法應用于膠原酶。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中存在的技術缺陷，而提供一種用于篩選微生物胞外膠原酶的酶譜方法,利用膠原酶對膠原蛋白的特異性降解作用對膠原酶進行酶譜分析。

為實現本發明的目的所采用的技術方案是：

一種用于篩選微生物胞外膠原酶的酶譜方法，包括電泳和凝膠的處理步驟，所述電泳過程中所采用的凝膠為在10％SDS-PAGE凝膠中添加質量體積比濃度為0.1％的Ⅰ型膠原蛋白。

所述凝膠的處理過程為：電泳結束后先將凝膠用洗脫液在室溫條件下振蕩洗脫2次，隨后用漂洗液在室溫條件下振蕩漂洗2次，最后將凝膠用孵育液在37℃下靜置孵育12h；孵育結束后將凝膠先經質量體積比為0.1％的考馬斯亮藍R-250染色液染色1h，再經脫色液室溫振蕩脫色直至透明條帶清晰；

所述洗脫液的組成為：由pH值為7.6、濃度為50mmol/L?Tris-HCl緩沖液、聚乙二醇辛基苯基醚和CaCl₂組成，所含聚乙二醇辛基苯基醚的體積百分比為2.5％，CaCl₂的濃度為5mmol/L；

所述漂洗液的組成為：由pH值為7.6、濃度為50mmol/L?Tris-HCl緩沖液和CaCl₂組成，CaCl₂的濃度為5mmol/L；

所述孵育液的組成為：pH值為7.6、濃度為50mmol/L?Tris-HCl緩沖液、十二烷基聚乙二醇醚、NaCl和CaCl₂，其中，十二烷基聚乙二醇醚的濃度為0.02％，NaCl的濃度為200mmol/L、CaCl₂的濃度為5mmol/L；

所述考馬斯亮藍染色液的組成為：1L考馬斯亮藍染色液中含有1.0g考馬斯亮藍R-250、450mL甲醇和100mL冰醋酸；

所述脫色液的組成為：1L脫色液中含有100mL無水甲醇和100mL冰乙酸。