[發(fā)明專利]一種轉(zhuǎn)iaaM基因提高黃花蒿中青蒿素含量的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410278312.9
• 申請(qǐng)日: 2014-06-20
• 公開（公告）號(hào): CN104059940A
• 公開（公告）日: 2014-09-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙燕;荊風(fēng)雪;張學(xué)文;傅瑤;宋南;劉愛云
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 趙燕
• 主分類號(hào): C12N15/84
• 分類號(hào): C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及屬于生物技術(shù)領(lǐng)域的提高青蒿素含量的方法，特別涉及一種轉(zhuǎn)iaaM基因提高黃花蒿中青蒿素含量的方法。

背景技術(shù)

青蒿素是從植物黃花蒿中提取的含過氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯藥物，是當(dāng)今瘧疾治療的最理想藥物，能有效治療對(duì)傳統(tǒng)藥物氯奎產(chǎn)生抗藥性的瘧原蟲感染。青蒿素主要從黃花蒿中直接提取得到，或提取黃花蒿中含量較高的青蒿酸，然后半合成而成。目前除黃花蒿、青蒿外，尚未發(fā)現(xiàn)含有青蒿素的其它天然植物資源。因此黃花蒿仍是青蒿素藥物生產(chǎn)的惟一藥源。

雖然黃花蒿系世界廣泛分布品種，但青蒿素含量隨產(chǎn)地不同差異極大。研究證實(shí)黃花蒿中合成青蒿素的主要部位是其葉片表面的腺毛細(xì)胞。由于其合成部位的特異性，黃花蒿中青蒿素的含量僅占葉片干重的0.8%-1.4%，因而使其分離成本高、產(chǎn)量低、廢棄物多。野生黃花蒿中青蒿素含量很低，僅為0.1-0.8%。通過雜交和定向育種開展了大量提高黃花蒿中青蒿素含量的嘗試，但目前報(bào)道的最高青蒿素含量也未超過1.4%，說明了常規(guī)選育方法的局限性。本發(fā)明提供一種采用基因工程的植物遺傳轉(zhuǎn)化法提高黃花蒿中青蒿素含量的方法，涉及到生長素合成酶基因在其腺毛細(xì)胞中特異表達(dá)，是一種運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)開展的黃花蒿育種新方法。

本發(fā)明采用的iaaM基因是植物通過色氨酸途徑合成生長素(IAA)的關(guān)鍵酶，該基因最初來自于感染植物的土壤細(xì)菌根癌農(nóng)桿菌，為編碼色氨酸單加氧酶的基因，在植物中表達(dá)后能利用色氨酸合成吲哚乙酸，即生長素。因此轉(zhuǎn)化iaaM基因后的植物細(xì)胞由于能過量合成生長素，使其分裂和分化不受植株整體控制，出現(xiàn)如冠癭瘤的惡性生長現(xiàn)象。但若使用特異性啟動(dòng)子使iaaM基因在特定的組織或細(xì)胞中表達(dá)，就有可能促進(jìn)特定細(xì)胞和組織的生長。本發(fā)明使用腺毛細(xì)胞特異性啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子是來自于擬南芥表皮毛細(xì)胞特異性表達(dá)的Gl2基因啟動(dòng)子，能在黃花蒿中有效作用，保證iaaM基因僅在腺毛細(xì)胞中表達(dá)，從而不影響植株的整體發(fā)育，提高其青蒿素含量。

根據(jù)本發(fā)明要解決的技術(shù)問題和本發(fā)明采用的技術(shù)方案進(jìn)行專利檢索，其檢索結(jié)果如下。

專利1：

專利權(quán)人為上海交通大學(xué)，申請(qǐng)?zhí)枮?00710170423.8。本發(fā)明是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的轉(zhuǎn)ads基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本發(fā)明從青蒿中克隆紫穗槐二烯合成酶ADS基因，構(gòu)建含ads基因的植物表達(dá)載體，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將ads基因轉(zhuǎn)入青蒿并再生出植株，PCR檢測(cè)外源目的基因ads的整合情況，高效液相色譜法及蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素的含量，篩選獲得青蒿素含量提高的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿泰的含量顯著提高，最高達(dá)到非轉(zhuǎn)化對(duì)照植株的2.3倍，從而提供了一種提高青蒿中青蒿素含量的方法，為利用轉(zhuǎn)基因青蒿大規(guī)模生產(chǎn)青蒿素打下了基礎(chǔ)。

專利2：

專利權(quán)人為上海交通大學(xué)，申請(qǐng)?zhí)枮?00710170427.6。本發(fā)明是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的用RNA干擾提高青蒿中青蒿素含量的方法。本發(fā)明從青蒿中克隆鯊烯合酶SQS基因sqs片段，構(gòu)建含sqs hairpin的植物表達(dá)載體，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將sqs hairpin基因轉(zhuǎn)入青蒿中獲得再生植株，PCR和RT - PCR檢測(cè)目的基因sqs hairpin的整合和表達(dá)情況，高效液相色譜法及蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定青蒿中青蒿素的含量，篩選獲得青蒿素合量提高的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素的含量顯著提高，最高達(dá)到非轉(zhuǎn)化對(duì)照植株的2.8倍，從而提供了一種提高青蒿中青蒿素含量的方法，為利用轉(zhuǎn)基因青蒿大規(guī)模生產(chǎn)青蒿素打下了基礎(chǔ)。

專利3：

專利權(quán)人為上海交通大學(xué)，申請(qǐng)?zhí)枮?01110099411.7。本發(fā)明是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的轉(zhuǎn)AOC 基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本發(fā)明從青蒿中克隆丙二烯氧化環(huán)化酶AOC基因，構(gòu)建含AOC基因的植物表達(dá)載體，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將AOC基因轉(zhuǎn)入青蒿并再生出植株，PCR檢測(cè)外源目的基因AOC的整合情況，高效液相色譜法及蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素的含量，篩選獲得青蒿素含量提高的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素的含量顯著提高，在非轉(zhuǎn)化普通青蒿含量為1.53mg/g DW時(shí)，同時(shí)期轉(zhuǎn)AOC基因青蒿中青蒿素的含量最高達(dá)到10.17mg/g DW，其含量是非轉(zhuǎn)化青蒿含量的6.65倍，從而提供了一種提高青蒿中青蒿素含量的方法，為利用轉(zhuǎn)基因青蒿大規(guī)模生產(chǎn)青蒿素打下了基礎(chǔ)。

專利4：