[發(fā)明專利]一種轉iaaM基因提高黃花蒿中青蒿素含量的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410278312.9
• 申請日: 2014-06-20
• 公開（公告）號: CN104059940A
• 公開（公告）日: 2014-09-24
• 發(fā)明（設計）人: 趙燕;荊風雪;張學文;傅瑤;宋南;劉愛云
• 申請（專利權）人: 趙燕
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種轉iaaM基因提高黃花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、構建iaaM基因在黃花蒿腺毛細胞特異表達的載體：將iaaM基因與Gl2基因啟動子重組，克隆到Ti質粒的T-DNA區(qū)pBI121質粒的HindIII及PstI位點，以NPT-II基因為選擇標記基因，載體以pBI121作為出發(fā)載體進行改造和載體構建，獲得pBI121-Gl2-iaaM的重組Ti質粒，提取重組Ti質粒做PCR檢測和酶切驗證；

步驟2、工程化根癌農(nóng)桿菌菌株的制備：構建的重組Ti質粒通過電激轉化法轉化根癌農(nóng)桿菌，轉化后的根癌農(nóng)桿菌經(jīng)過篩選、培養(yǎng)至對數(shù)生長后期，所述的根癌農(nóng)桿菌為LBA4404；

步驟3、利用所構建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉化黃花蒿，獲得經(jīng)PCR檢測的轉基因黃花蒿植株，具體包括以下步驟：

1）外植體預培養(yǎng)：黃花蒿種子經(jīng)消毒后在1/2MS培養(yǎng)基上發(fā)芽成苗，待苗長至4-6cm時剪取黃花蒿幼苗子葉用于轉化；

2）黃花蒿幼苗子葉與根癌農(nóng)桿菌的共培侵染轉化：將黃花蒿幼苗子葉在培養(yǎng)至對數(shù)生長后期的根癌農(nóng)桿菌液中侵泡30min；

3）誘導愈傷組織：將共培侵染轉化后的黃花蒿子葉以消毒后的MS培養(yǎng)液沖洗3遍，轉接到MS+1% 6-BA+0.05% NAA+30g/L 蔗糖+7g/L瓊脂+500 mg/L羧芐青霉素+20 mg/L卡那霉素的MS1固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2d進行誘導抗性愈傷組織；

4）抗性再生植株的篩選：抗性愈傷組織團生長至3-4mm大小，取出葉盤采用無菌吸水紙吸干其表面多余水分，將葉盤平放到MS+1.5mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+500mg/L羧芐青霉素+20mg/L卡那霉素的MS2培養(yǎng)基上誘導分化出芽，具體過程為愈傷組織稍微壓入培養(yǎng)基，溫度控制在22-24℃之間，16h/8h進行光暗交替培養(yǎng)；28-35d后誘導出抗性叢生芽，切下帶芽愈傷部分，插入MS2培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至莖分化和長高，待抗性芽生長至3-5cm后，將其從愈傷組織基部切下，并將其移入1/2 MS+0.5mg/L NAA+0.5mg/L IAA+30 g/L蔗糖+7g/L瓊脂的MS3生根培養(yǎng)基中誘導其生根，此時對每一顆陽性苗進行編號，溫度控制在22-24℃之間，16h/8h進行光暗交替培養(yǎng)；根誘導分化14d后，將分化苗移至消毒蛭石中，培養(yǎng)室內煉苗7d，然后移栽至營養(yǎng)土中生長得到轉基因黃花蒿植株；

步驟4、轉基因黃花蒿植株的PCR檢測和腺毛細胞發(fā)育觀察：提取轉基因黃花蒿植株葉片DNA，PCR法進行基因擴增檢測，并對轉基因黃花蒿腺毛發(fā)育細胞情況及青蒿素含量進行觀察與分析；

步驟5、建立轉基因黃花蒿品系：篩選青蒿素含量顯著提高的轉基因黃花蒿植株，通過組織培養(yǎng)繁殖建立轉基因高青蒿素含量的黃花蒿品系。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種轉iaaM基因提高黃花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述步驟1中Gl2基因啟動子獲得途徑為：從GenBank中的Nucleotide數(shù)據(jù)庫中獲得擬南芥Gl2基因核心序列，根據(jù)其核苷酸序列設計兩條特異性引物，對擬南芥基因組DNA擴增，獲得Gl2基因啟動子。

3.根據(jù)權利要求1所述的一種轉iaaM基因提高黃花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述步驟2中電激轉化法過程為制備的重組Ti質粒DNA 0.1 ug與1 mL感受態(tài)根癌農(nóng)桿菌混合后置于電激杯，電激轉化儀以細菌轉化模式進行電激轉化。

4.根據(jù)權利要求1所述的一種轉iaaM基因提高黃花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述步驟2中根癌農(nóng)桿菌篩選與培養(yǎng)過程為將轉化后的根癌農(nóng)桿菌鋪于含卡那霉素50 ug/mL和利福平20 ug/mL的YEB培養(yǎng)基上篩選，篩選得到的根癌農(nóng)桿菌在YEB液體培養(yǎng)基28-30℃搖瓶培養(yǎng)過夜至對數(shù)生長后期，按1:10接種到擴大的培養(yǎng)體系繼續(xù)搖瓶4 h。

5.根據(jù)權利要求1所述的一種轉iaaM基因提高黃花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述步驟4中轉基因黃花蒿植株腺毛發(fā)育細胞情況及青蒿素含量觀察與分析過程為取轉基因黃花蒿幼嫩葉片，置于熒光體視顯微鏡下進行熒光顯微觀察，統(tǒng)計單位葉面積的腺毛細胞數(shù)，與對照非轉基因黃花蒿比較，可以估測青蒿素含量提高情況。