[發(fā)明專利]一種微量提取辣椒單粒種子DNA的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410277785.7
• 申請(qǐng)日: 2014-06-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104017801A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-09-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王飛;姚明華;李寧;焦春海
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種適用于辣椒單粒種子基因組DNA的微量提取方法。

背景技術(shù)

辣椒種子純度的鑒定方法有幼苗形態(tài)特征鑒定法、辣椒同工酶電泳鑒定法、田間小區(qū)種植鑒定法及DNA分子標(biāo)記鑒定法。傳統(tǒng)的純度鑒定是通過(guò)海南田間小區(qū)反季節(jié)種植鑒定和本地田間小區(qū)正季種植鑒定。前者可在農(nóng)戶播種之前了解種子純度，雖然可以避免因種子不純給農(nóng)戶造成的損失，但公司的損失已無(wú)可挽回(制種款已在收種時(shí)付給制種農(nóng)戶)，而且海南鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性差，時(shí)間也偏晚，純度結(jié)果出來(lái)時(shí)，早已進(jìn)入種子銷售旺季，影響公司經(jīng)營(yíng)策略。后者雖然結(jié)果準(zhǔn)確，但時(shí)間過(guò)晚，公司和購(gòu)種農(nóng)戶的損失都已發(fā)生，不可避免，只能作為種子的后控措施。SCAR分子標(biāo)記鑒定技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)雜交辣椒種子純度，速度快，準(zhǔn)確性高，可有效防止制種農(nóng)戶參假制假。

應(yīng)用SCAR分子標(biāo)記鑒定過(guò)程，對(duì)基因組DNA高效提取是基本環(huán)節(jié)。目前已有多種葉片DNA提取方法，如SDS、CTAB等方法均可獲取高質(zhì)量、高產(chǎn)量的基因組DNA。這些方法應(yīng)用于SCAR標(biāo)記輔助育種或者雜交種純度鑒定對(duì)大量樣本進(jìn)行分析時(shí)，要求種子發(fā)育長(zhǎng)出葉片，整個(gè)過(guò)程步驟繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)，對(duì)儀器設(shè)備有特殊要求等，這些缺點(diǎn)限制了其應(yīng)用。

因此，為了及時(shí)準(zhǔn)確地完成對(duì)大批量樣本的SCAR分子標(biāo)記鑒定工作，必須建立簡(jiǎn)單、高效、穩(wěn)定的DNA提取方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是一種微量提取辣椒單粒種子DNA的方法，方法簡(jiǎn)單、高效、穩(wěn)定。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：

一種微量提取辣椒單粒種子DNA的方法，其步驟是：

A、隨機(jī)抽取辣椒干種子1粒洗凈后，先將種子放入適當(dāng)容器中，再緩緩倒入50～55℃水，邊倒邊攪拌，使種子受熱均勻，15-20分鐘后，水溫降至常溫(20-25℃，以下同)，繼續(xù)浸種4小時(shí)；

B、在液氮中磨成粉末，轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中；

C、每管再加100μl?DNA提取緩沖液(50mmol/L?Tris/HCl?pH8.0,10mmol/L?EDTA?pH8.0,100mol/LNaCl,1.0％SDS(W/V),8％PVP(W/V),10mmol/Lβ-巰基乙醇)的提取緩沖液，混勻；

D、置于65℃水浴中保溫10min；

E、加入25μl3mol/L?NaAc輕輕混勻，冰浴20min，13000r/min離心10min。取上清液置于新離心管中，加入預(yù)冷(-20℃)的等體積異丙醇混勻，13000r/min離心5min。棄上清，靜置干燥后，用預(yù)冷的75％乙醇清洗后干燥。加入20μl無(wú)菌雙蒸水及2μl3mol/L?NaAc，充分混勻，加入50μl無(wú)水乙醇輕輕混勻，置于-70℃深凍1h。13000r/min離心5min，棄上清，用預(yù)冷的75％乙醇清洗后干燥。將核酸溶于5μl無(wú)菌雙蒸水，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

前述的DNA提取方法，步驟A所取的辣椒單粒種子必須為完整、飽滿的種子，種皮不能粘附任何其他物質(zhì)；

步驟C所用的DNA提取緩沖液成份為50mmol/L?Tris/HCl?pH8.0,10mmol/L?EDTA?pH8.0,100mol/LNaCl,1.0％SDS(W/V),8％PVP(W/V),10mmol/Lβ-巰基乙醇。

步驟E所用的DNA保存溶液為5μl的無(wú)菌雙蒸水。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(一)本發(fā)明所述的DNA提取方法不需要等到種子萌發(fā)長(zhǎng)出葉片才能通過(guò)葉片提取基因組DNA，直接通過(guò)單粒種子就可提取基因組DNA。

(二)本發(fā)明所述的DNA提取方法省去了常規(guī)方法中氯仿抽提蛋白質(zhì)的步驟，方法簡(jiǎn)單，避免了常規(guī)方法中因步驟繁瑣而可能造成的DNA提取失敗。

(三)本發(fā)明所述的DNA提取方法提取的基因組DNA量雖少，但質(zhì)量較好，完全可以滿足SCAR-PCR分子標(biāo)記分析的需要。

附圖說(shuō)明

圖1為采用本發(fā)明DNA提取方法提取的辣椒單粒種子基因組DNA在1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，1～5為楚椒808。

圖2為采用本發(fā)明的DNA提取方法提取的楚椒808的基因組DNA采用SCAR引物NUTR020進(jìn)行PCR擴(kuò)增后經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠帶你用分析圖譜，圖中譜帶1～2代表楚椒808帶型，譜帶3代表母本帶型，M為markerⅤ。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。