[發明專利]一種具有預防治療動脈粥樣硬化作用的蛋白功能多肽的酵母重組表達、純化及應用

有效

• 申請號: 201410277485.9
• 申請日: 2014-06-19
• 公開（公告）號: CN104109686B
• 公開（公告）日: 2018-03-30
• 發明（設計）人: 劉慶平;李敬達;遲彥;王仁軍
• 申請（專利權）人: 大連大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K14/435;C07K1/36;C07K1/22;C07K1/34;G01N33/68;A61P9/10;C12R1/19
• 代理公司: 大連八方知識產權代理有限公司21226
• 代理人: 任洪成

技術領域

本發明屬于生物工程領域，具體涉及oxLDL結合蛋白人血清β₂-糖蛋白I第五功能域的酵母重組表達、純化及其在診斷預防和治療動脈粥樣硬化方面的應用。

背景技術

動脈粥樣硬化（Athersclerosis，AS），隨著人們生活水平的日益提高已成為威脅人類健康的重要因素。低密度脂蛋白（Low density lipoprotein，LDL）的氧化產物，氧化低密度脂蛋白（oxLDL）被認為是動脈硬化發生的主要誘發因子（C. K. Glass, and J. L. Witztum, Cell，2001）。oxLDL能夠與血清中的β_2-糖蛋白I（β₂-glycoprotein I，β₂-GP I) 相結合并形成穩定的二元復合物，oxLDL/β₂-GP I二元復合物可作為一種自身免疫性抗原與系統性紅斑狼瘡SLE或抗磷脂綜合癥APS患者血清中的自身抗體形成三元復合物，經由巨噬細胞吞噬攝取形成泡沫細胞，從而導致自身免疫性動脈粥樣硬化和血栓形成。

β₂-GPI也被稱為apoliprotein H（apo H）, 主要由肝臟合成，在甘油三酯代謝中具有十分重要作用。β₂-GPI在血清中生理濃度為200μg/mL，該蛋白含有326 個氨基酸，分子量大約為 50KDa，由5 個結構域組成，其中第五結構域的C281KNKEKKC288區和S311-K317柔性環含有明顯正電荷，能夠與oxLDL的陰性電荷表位結構結合并形成復合物。研究發現，在SLE、APS或心梗患者血清及動脈粥樣硬化巢內存在 oxLDL與β₂-GP I形成的二元復合物。目前，β₂-GP I結合oxLDL被認為是機體抗動脈粥樣硬化的一種生物學保護作用，β₂-GP I與oxLDL結合是通過其第五功能結構域（DⅤ）來實現，因此酵母重組表達的β₂-GP I第五功能結構域（P.rβ₂-GP I-DV）很可能是阻斷oxLDL致病作用的極好功能肽。

研究發現oxLDL上的陰性表位結構為7-酮基膽固醇-9-羧基壬烷（oxLig-1），它介導了oxLDL與β₂-GP I的結合。導致β₂-GP I與oxLDL結合后使隱藏在其第一或第四結構域的抗原表位暴露，致動脈硬化血栓性自身抗體與oxLDL/β2-GPI復合物結合，形成免疫三元復合物，加速了巨噬細胞經由Fcγ受體吞噬攝取oxLDL形成泡沫細胞的進程，從而引起了自身免疫性動脈粥樣硬化和血栓的發生。 酵母重組表達的β₂-GP I第五功能結構域（P.rβ₂-GP I-DV）通過競爭性結合oxLDL，抑制oxLDL/β2-GPI復合物形成以及與自身抗體形成三元復合物，達到預防和治療動脈粥樣硬化和血栓形成的目的。體外獲得β₂-GP I第五功能結構域就顯得十分必要，而要獲得大量、高純度及良好生物學活性的β₂-GP I第五功能結構域，酵母重組表達則成為最佳的手段。在本發明中，我們構建了β₂-GP I第五功能結構域的酵母表達載體，將其導入X-33酵母表達工程菌種，實現了β₂-GP I第五功能結構域在酵母系統中的表達，最終將獲得的重組蛋白P.rβ₂-GP I-DV應用于抑制oxLDL的攝取、阻止泡沫細胞形成以及oxLDL誘導的炎癥反應藥物開發當中。 此類研究尚未見報道。

發明內容

本發明的目的是建立了一整套P.rβ₂-GP I-DV酵母重組表達與純化的體系，通過此體系能夠高效獲得具有結合陰性磷脂如心磷脂（CL）、oxLDL，oxLig-1等生物學活性的P.rβ₂-GP I-DV重組蛋白，并且證明了通過此系統獲得的P.rβ₂-GP I-DV重組蛋白在生物學活性方面明顯高于原核表達系統所表達的β₂-GP I第五功能結構域重組蛋白（E.rβ₂-GP I-DV）；