[發明專利]一種具有預防治療動脈粥樣硬化作用的蛋白功能多肽的酵母重組表達、純化及應用

有效

• 申請號: 201410277485.9
• 申請日: 2014-06-19
• 公開（公告）號: CN104109686B
• 公開（公告）日: 2018-03-30
• 發明（設計）人: 劉慶平;李敬達;遲彥;王仁軍
• 申請（專利權）人: 大連大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K14/435;C07K1/36;C07K1/22;C07K1/34;G01N33/68;A61P9/10;C12R1/19
• 代理公司: 大連八方知識產權代理有限公司21226
• 代理人: 任洪成

1.P.rβ₂-GPⅠ-DV重組蛋白將血清中穩定存在的oxLDL/β₂-GPⅠ二元復合物打開的用途，所述用途是非治療目的，所述的P.rβ₂-GPⅠ-DV是指酵母重組表達的β₂-GPⅠ第五功能結構域重組蛋白，P.rβ₂-GPⅠ-DV重組蛋白的制備方法如下：

一、將β₂-GP I序列根據下列的要求進行合成，上游引物序列包括：5’端含有保護堿基、XhoI酶切位點、信號肽識別位點以及β₂-GPⅠ第五功能結構域 5’端部分氨基酸編碼基因序列；下游引物序列包括：5’端含有保護堿基、Xbal I酶切位點、終止密碼子、6個His，GGGGS 柔性肽以及β₂-GPⅠ第五功能結構域3’端部分氨基酸編碼基因的互補序列，具體上下游引物序列如下：

上游引物：

5’-CCGCTCGAGAAAAGAAAAGCATCTTGTAAAGTACCTGTG-3’ 39bp

下游引物：

5’-GCTCTAGATTATCAATGATGATGATGATGATGGGAACCACCACCACCGCATGGCTTTACATCGGA-3’ 65bp

二、表達P.rβ₂-GPⅠ-DV的酵母重組菌株的構建過程如下：

（1）β₂-GPⅠ第五功能結構域基因片段的獲得：

以含有β₂-GPⅠ片段的T載體為模板，使用上游引物和下游引物對β₂-GPⅠ-DV基因進行PCR擴增，PCR產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，之后將目標條帶切下并由凝膠回收試劑盒回收得到β₂-GPⅠ第五功能結構域的基因片段；

（2）酵母表達質粒pPICZαA-DV的構建

1）β₂-GPⅠ第五功能結構域基因片段的TA克隆

將β₂-GPⅠ第五功能結構域基因片段連接至pMD19-T simple vector，連接體系為：pMD 19-T Simple Vector ，0.03 pmol 1μL；目的基因，0.303 pmol 2 μL；H₂O ，2μL ；Solution ，5μL，之后轉化至大腸桿菌JM109感受態細胞中，涂布于含有抗性的LB平板，獲得的菌落進行PCR鑒定，并挑選陽性克隆擴大培養后進行測序，測序結果與人的β₂GPⅠ-DV序列比對，鑒定序列與其一致正確后將重組質粒命名為pMD19-T-β₂-GPⅠ-DV；

2） 重組表達載體的構建及鑒定

將含有pMD19-T-β₂-GPⅠ-DV及pPICZαA質粒的大腸桿菌JM109分別擴大培養并進行質粒提取，之后用Xbal I、 Xho I進行雙酶切，切膠回收酶切產物β₂-GPⅠ第五功能結構域基因片段和pPICZαA目的片段，連接16 h 以上，得到連接產物，將連接產物轉化JM109感受態細胞，涂布到含有氨芐抗性的Low salt LB固體培養基，培養16 h后挑選陽性菌落進行擴大培養，并進行質粒提取及Xbal I、 Xhol雙酶切鑒定，將構建成功的重組表達質粒命名為pPICZαA-β₂-GPⅠ-DV；

(3)P.rβ₂-GPⅠ-DV酵母重組表達菌株的構建

1)pPICZαA-β₂-GPⅠ-DV質粒電轉化畢赤酵母X-33

提取pPICZαA-β₂-GPⅠ-DV質粒，并進行SacI單酶切，將5-10μg酶切產物經乙醇沉淀后溶于10μL超純水中，與80μL當日制備的X-33感受態細胞混勻并轉移至1cm電轉杯中，冰上孵育5min，冰育后使用Bio-rad電轉化儀進行電轉，轉化的條件為：電壓2000 V，電阻200Ω，電激時間4-5 ms，電激完畢，立即在電轉杯中加入1 mL 冰冷的1 M 山梨醇， 28℃孵育1h，之后加入1mL YPD培養基，28℃震蕩培養1h，將培養液離心濃縮后涂于含有抗性的YPD固體培養基，28℃培養72h；

2）原位雙膜法快速篩選陽性表達菌株

在BMMY平板上置一同樣大小的NC膜，并將菌落點于膜上，30 ℃倒置孵育48h，期間在蓋子上每日補加1mL甲醇和1mL水，將醋酸纖維素薄膜置于NC膜上，用涂布棒輕壓使醋酸纖維素薄膜完全濕潤并趕盡氣泡，使所有菌落轉移到醋酸纖維素薄膜上以做菌落備份，將NC膜取下，沖去菌落，沸水中煮5min，5 %脫脂奶粉37 ℃封閉1h，TBST洗3 次，每次10min，一抗抗體為抗HIS-tag，室溫孵育2 h , TBST 洗膜3次，二抗室溫孵育1h ，TBST 洗膜3次， ECL顯色，并于暗室中顯影，使用Quantity One軟件對顯影膠片進行灰度比較，篩選得到重組蛋白高表達量陽性菌株，即為表達P.rβ₂-GPⅠ-DV的酵母重組菌株；

（4）P.rβ₂-GPⅠ-DV在畢赤酵母X-33中的誘導表達及純化

使用BMGY-BMMY 培養基體系，將篩選得到的陽性菌株接種到1L BMGY培養基中，28℃培養36h；1500rpm離心菌液，棄上清，加入100mL含有1%甲醇的BMMY培養基，28℃誘導表達96h，每隔24h補加1%甲醇，P.rβ₂-GPⅠ-DV重組蛋白為分泌表達形式存在，將發酵液4℃、6000rpm離心30min后收集上清液，取少量上清液-80℃保存，其余皆調節pH到8.0，0.45μm濾膜過濾上清液后，鎳離子親和層析柱純化蛋白，所得到的純化蛋白經超濾濃縮后，進行 SDS-PAGE電泳分析及Western-blot鑒定，能見明顯目標條帶，證明重組蛋白純化成功。