[發(fā)明專利]一種梨果實(shí)果汁含量主效QTL位點(diǎn)的SNP分子標(biāo)記引物及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410277426.1
• 申請日: 2014-06-19
• 公開（公告）號(hào): CN104032024B
• 公開（公告）日: 2017-01-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張紹鈴;吳俊;李雷廷;姚改芳;劉倫;楊雅楠;謝智華
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司32218
• 代理人: 傅婷婷,徐冬濤

1.一種與梨果實(shí)果汁含量主效QTL位點(diǎn)qJuice緊密連鎖的SNP標(biāo)記引物，其特征在于：正向引物JUICE‐F：SEQ?ID?NO.1，反向引物JUICE‐R：SEQ?ID?NO.2。

2.權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)記引物對在梨分子育種中的應(yīng)用，其特征在于利用所述的引物對基于高分辨率溶解曲線鑒定檢測登錄號(hào)為AJSU00000000的梨基因組序列scaffold171.0的第123191個(gè)堿基處是否存在一個(gè)與梨果實(shí)果汁含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)qJuice，同時(shí)檢測該QTL位點(diǎn)上的多態(tài)性表達(dá)果實(shí)果汁含量的差異，預(yù)測梨果實(shí)果汁含量的高低，以實(shí)現(xiàn)梨果實(shí)果汁含量性狀的早期鑒定和篩選。

3.權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)記引物對在檢測梨果實(shí)果汁含量主效QTL位點(diǎn)qJuice及其SNP多態(tài)性中的應(yīng)用。

4.權(quán)利要求1所述的引物用于檢測梨果實(shí)果汁含量主效QTL位點(diǎn)qJuice的SNP標(biāo)記方法，其特征在于：利用權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)記引物對梨基因組DNA進(jìn)行HRM反應(yīng)，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列大小在215bp，表明存在一個(gè)與梨果汁含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)qJuice；PCR循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解，最后，在480II的Gene?Scanning軟件中1.5version自動(dòng)生成擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線，分別以已知梨果汁含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)qJuice上表達(dá)果汁含量多的品種和表達(dá)果汁含量少的品種為對照，檢測QTL位點(diǎn)qJuice上的多態(tài)性表達(dá)果汁含量的差異。如果未知品種得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線與對照的顏色相同、線型相似，則表示在果汁含量主效QTL位點(diǎn)qJuice上的多態(tài)性表達(dá)的果汁含量和對照相似。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的SNP標(biāo)記方法，其特征在于：所述的已知與梨果汁含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)qJuice上多態(tài)性表達(dá)果汁含量多的品種為‘碭山酥梨’，表達(dá)果汁含量少的品種為‘八月紅’。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的SNP標(biāo)記方法，其特征在于：所述的HRM反應(yīng)的反應(yīng)體系按照480High?Resolution?Melting?Master試劑盒中的說明書進(jìn)行，HRM分析是在480II熒光定量PCR儀上進(jìn)行；10μL反應(yīng)體系：含有2ng·μL^‐1梨基因組DNA模板、1×Master?Mix、2.0mmol·L^‐1MgCl₂、0.2mmol·L^‐1權(quán)利要求1所述的引物；擴(kuò)增程序采用降落式PCR：95℃預(yù)變性10min，然后95℃變性10s、60～55℃，每循環(huán)下降0.5℃，退火15s、72℃延伸12s的程序進(jìn)行45個(gè)循環(huán)；PCR循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解的程序?yàn)椋?5℃1min，40℃1min，65℃1s，再從65℃連續(xù)升溫至95℃，每升高0.04℃，收集熒光1次，最后降溫至40℃。

7.一種與梨果實(shí)果汁含量主效QTL位點(diǎn)qJuice緊密連鎖的SNP標(biāo)記，其特征在于該分子標(biāo)記由引物對：正向引物JUICE‐F：SEQ?ID?NO.1和反向引物JUICE‐R：SEQ?ID?NO.2擴(kuò)增梨基因組DNA得到。

8.權(quán)利要求7所述的SNP標(biāo)記在梨分子育種中的應(yīng)用，其特征在于該分子標(biāo)記位于梨的第5連鎖群的11.5cM處，Kruskal-Wallis統(tǒng)計(jì)測驗(yàn)值為16.238，在α＝0.001顯著水平下顯著，利用區(qū)間作圖法的LOD值為3.15，解釋15.6％的遺傳變異。

9.權(quán)利要求7所述的SNP標(biāo)記在檢測梨果實(shí)果汁含量主效QTL位點(diǎn)qJuice及其SNP多態(tài)性中的應(yīng)用。

10.權(quán)利要求7所述的SNP標(biāo)記用于檢測梨果實(shí)果汁含量主效QTL位點(diǎn)qJuice的SNP標(biāo)記方法，其特征在于：利用權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)記引物對梨基因組DNA進(jìn)行HRM反應(yīng)，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列大小在215bp，表明存在一個(gè)與梨果汁含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)qJuice；PCR循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解，最后，在480II的Gene?Scanning軟件中1.5version自動(dòng)生成擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線，分別以已知梨果汁含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)qJuice上表達(dá)果汁含量多的品種和表達(dá)果汁含量少的品種為對照，檢測QTL位點(diǎn)qJuice上的多態(tài)性表達(dá)果汁含量的差異。如果未知品種得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線與對照的顏色相同、線型相似，則表示在果汁含量主效QTL位點(diǎn)qJuice上的多態(tài)性表達(dá)的果汁含量和對照相似；其中，所述的已知與梨果汁含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)qJuice上多態(tài)性表達(dá)果汁含量多的品種為‘碭山酥梨’，表達(dá)果汁含量少的品種為‘八月紅’。