[發明專利]一種快速檢測非結核分枝桿菌的分子信標探針及檢測方法

有效

• 申請號: 201410276800.6
• 申請日: 2014-06-19
• 公開（公告）號: CN104032023A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發明（設計）人: 洪冉;方華成;劉振世
• 申請（專利權）人: 洪冉
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/32
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 徐關壽

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，特別涉及一種分子信標探針和試劑盒，通過使用熒光原位雜交的手段，檢測樣品中少量的非結核分枝桿菌。

背景技術

根據中國衛生部組織的第四次全國結核病流行病抽樣調查(2000年)得出的結果，我國有4億人感染過結核菌，現有的傳染性結核病人達200萬人，結核病的人數位居世界第二，僅次于印度。中國衛生部2006年3月公布的全國傳染病疫情報告中指出，肺結核仍然占甲、乙類傳染病種中發病數和死亡數的首位。大部分的結核病人或生活在結核病高發地區的居民，都很難得到迅速、準確的診斷。雖然非結核分枝桿菌(non-tuberculous?mycobacterium?species,NTM)的特性有別于結核分枝桿菌，但常常會引起結核樣病變，并且對常用的抗結核菌藥物耐受。臨床上經常將非結核分枝桿菌感染誤診為結核桿菌感染，這不僅會影響患者的診斷與治療，也會導致結核疫情資料的錯誤。因此在結核病診斷中，快速鑒定或區分結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌感染對于病人的治療、醫院的傳染病防治都至關重要。

目前臨床上檢測結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌最常用的方法是抗酸染色鏡檢法，該方法具有簡單、快速、成本低的優點，缺點是靈敏度低，痰內或者其它標本內含菌量少時往往不能得出陽性結果，并且不能區分是結核分枝桿菌還是非結核分枝桿菌。

分子信標探針(Molecular?beacon?probe)，具有靈敏度高、特異性強、只有和靶序列雜交上了才會發出熒光等優點，被應用于熒光原位雜交。本發明通過對大量結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌菌株的16S?rRNA序列進行比對，挑選非結核分枝桿菌的特異性序列，設計、合成分子信標探針，建立穩定的分子信標原位雜交反應體系，克服了非結核分枝桿菌當前臨床檢測的諸多問題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種分子信標探針，通過熒光原位雜交的手段，建立一種快速、靈敏、特異性地檢測樣品中非結核分枝桿菌的方法。

一種快速檢測非結核分枝桿菌的分子信標探針，其特征在于，所述分子信標探針的堿基序列為：

Beacon?NTM：5’-CY3-CATTGTACGCCCAGTAATTCCGGACCAATG–BHQ1-3’；

所述探針的5’端用Cy3標記，3’端用BHQ1標記，熒光基團激發波長552nm，檢測波長570nm。

進一步地，所述分子信標濃度為10ng/μL。

本發明還提供了一種快速檢測非結核分枝桿菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：

(1)裂解液：4％(w/v)氫氧化鈉；

(2)雜交液：10％(w/v)硫酸葡聚糖，10mM?NaCl，20％(v/v)甲酰胺，0.1％(w/v)焦磷酸鈉，0.2％(w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，0.2％(w/v)聚鹿糖，5mM?Na2EDTA，0.1％(v/v)TritonX-100，50mM?Tris/HCl(pH7.5)，10ng/μL分子信標探針，所述分子信標探針的堿基序列為：

Beacon?NTM：5’-CY3-CATTGTACGCCCAGTAATTCCGGACCAATG–BHQ1-3’；

(3)終止液：1％(v/v)稀硫酸；

(4)洗滌液：5mM?Tris，15mM?NaCl，0.1％(v/v)Triton?X-100，pH值為10。

本發明最后提供了一種上述試劑盒快速檢測非結核分枝桿菌的方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)吸取10μL樣品滴在載玻片上，自然風干；

(2)在風干的樣品上加入10μL裂解液，待其自然風干后，浸入無水乙醇中，浸泡5分鐘；

(3)52℃雜交10分鐘；

(4)液侵泡1分鐘，終止反應；

(5)滴加封片劑后，用熒光顯微鏡鏡檢，用20×物鏡掃視和計數，用60或100×物鏡觀察細菌形態。