[發明專利]生產華根霉脂肪酶的黑曲霉基因工程菌及其制備方法

在審

• 申請號: 201410276599.1
• 申請日: 2014-06-20
• 公開（公告）號: CN105274124A
• 公開（公告）日: 2016-01-27
• 發明（設計）人: 張謙;張田;唐克軒;賈佳;林智;郭宏濤;王劍英
• 申請（專利權）人: 深圳市綠微康生物工程有限公司
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/80;C12N1/15;C12N9/20;C12R1/845;C12R1/685
• 代理公司: 深圳市萬商天勤知識產權事務所(普通合伙) 44279
• 代理人: 王志明

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，特別是涉及一種生產華根霉脂肪酶的黑曲霉基因工程菌及其制備方法，以及所述黑曲霉基因工程菌在生產華根霉脂肪酶中的應用。

背景技術

黑曲霉(Aspergillusniger)是一種重要的工業微生物，在工業酶制劑方面應用廣泛，可以產生脂肪酶、淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶等30多種酶制劑；此外黑曲霉用于食品釀造和加工方面已經有上百年的歷史，因此被美國FDA認定為GRAS(Generallyrecognizedassafe，通常認為是安全的)菌株，可以用于食品和藥品級酶制劑的生產。由于黑曲霉具備出色的蛋白質分泌能力、高度的安全性，成熟的發酵及后處理工藝，因此，常被作為宿主菌用以表達異源酶基因。

華根霉脂肪酶（Rhizopuschinensislipase，RCL）是絲狀真菌華根霉分泌的脂肪酶，研究表明RCL能夠顯著增加面包的比容、改善面包結構、延緩面包老化，與國內同類產品相比，RCL在改善面包和饅頭的硬度、彈性、膠著性和咀嚼性方面效果更佳，能夠替代傳統的化學改良劑（如溴酸鉀），具有重要應用價值。但是，天然的華根霉產脂肪酶能力有限，而且出于食品安全方面的考慮，它所分泌的脂肪酶不能直接作為食品添加劑。隨著分子生物學的發展，RCL的基因被克隆，研究人員在畢赤酵母中實現了RCL的高效表達（中國專利，公開號：CN102911888A），但是畢赤酵母發酵過程中需要添加甲醇，甲醇一種劇毒化學物質，微量的甲醇就會導致中樞神經損害、眼部損害及代謝性酸中毒，因此以甲醇作為誘導劑生產的RCL仍然不能作為食品添加劑。本發明人研究中發現，如果將RCL與其它真菌表達研究中的常用啟動子（如構巢曲霉色氨酸合成酶啟動子PtrpC、黑曲霉糖化酶啟動子PglaA等）融合時，不能有效實現RCL的表達；另外，如果將RCL的成熟肽與其它分泌信號融合時，在黑曲霉中不能有效地實現分泌表達。為了實現RCL在食品加工領域的應用，急需開發一種高產食品級的RCL的菌株。

發明內容

本發明提供一種生產華根霉脂肪酶的黑曲霉基因工程菌及其制備方法，所述黑曲霉基因工程菌能高效地分泌食品級的華根霉脂肪酶，脂肪酶活力最高達到263IU/mL，產生的華根霉脂肪酶分泌到胞外，無需破碎菌體，華根霉脂肪酶存在于培養基中，操作簡單，便于分離純化；并且該黑曲霉基因工程菌培養條件粗放，適合固體培養和液體深層發酵，在產酶條件下不會產生真菌毒素和抗生素，非常適合大規模生產食品級的華根霉脂肪酶。

為解決上述技術問題，本發明的一個方面是涉及一種華根霉脂肪酶表達盒，所述表達盒從5’至3’依次包含以下元件：

（1）擴展青霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動子Pgpdp；

（2）華根霉脂肪酶基因RCL；

（3）構巢曲霉色氨酸合成酶C基因的終止子TtrpC；

所述Pgpdp的序列為SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，所述RCL的編碼序列為SEQIDNO：2所示的核苷酸序列，所述TtrpC的序列為SEQIDNO：3所示的核苷酸序列。

本發明人經過廣泛而深入的研究，經過大量篩選，意外地發現，將華根霉RCL編碼基因，擴展青霉Pgpdp啟動子、構巢曲霉TtrpC終止子等元件組合在一起，可以實現RCL在黑曲霉中的高效表達。同時，本發明人還發現，采用RCL自身的信號肽序列，可以實現RCL的高效分泌表達，分泌水平遠高于RCL的成熟肽與其它分泌信號組合的情況。另外，采用擴展青霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動子Pgpdp可以實現RCL的高效表達，表達量遠高于其它啟動子，并且生產的RCL分泌到胞外，無需破碎菌體即可分離純化，操作簡單，便于后續產物的回收和精制。黑曲霉為GRAS菌株，它所表達的RCL可以作為食品添加劑，應用于各食品加工領域。

本發明的另一個方面還涉及一種表達載體，所述表達載體含有華根霉脂肪酶表達盒，并且分泌表達華根霉脂肪酶。

本發明的另一個方面還涉及一種黑曲霉基因工程菌，所述黑曲霉基因工程菌含有所述的華根霉脂肪酶表達盒或所述的表達載體，并且表達分泌表達華根霉脂肪酶。

所述的黑曲霉基因工程菌的制備方法包括如下步驟：

（1）獲得潮霉素抗性表達盒并克隆至目標質粒上，獲得潮霉素抗性的重組質粒；

（2）分別擴增華根霉的脂肪酶基因RCL、擴展青霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動子Pgpdp和構巢曲霉色氨酸合成酶C的終止子TtrpC，得到有強啟動子的RCL基因超表達盒；