[發(fā)明專利]生產(chǎn)華根霉脂肪酶的黑曲霉基因工程菌及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410276599.1
• 申請日: 2014-06-20
• 公開（公告）號: CN105274124A
• 公開（公告）日: 2016-01-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張謙;張?zhí)?/a>;唐克軒;賈佳;林智;郭宏濤;王劍英
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市綠微康生物工程有限公司
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/80;C12N1/15;C12N9/20;C12R1/845;C12R1/685
• 代理公司: 深圳市萬商天勤知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所(普通合伙) 44279
• 代理人: 王志明

1.一種華根霉脂肪酶表達(dá)盒，其特征在于，所述表達(dá)盒從5’至3’依次包含以下元件：

（1）擴(kuò)展青霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動子Pgpdp；

（2）華根霉脂肪酶基因RCL；

（3）構(gòu)巢曲霉色氨酸合成酶C基因的終止子TtrpC；

所述Pgpdp的序列為SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，所述RCL的編碼序列為SEQIDNO：2所示的核苷酸序列，所述TtrpC的序列為SEQIDNO：3所示的核苷酸序列。

2.一種表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體含有權(quán)利要求1所述的華根霉脂肪酶表達(dá)盒，并且分泌表達(dá)華根霉脂肪酶。

3.一種黑曲霉基因工程菌，其特征在于，所述黑曲霉基因工程菌含有權(quán)利要求1所述的華根霉脂肪酶表達(dá)盒或權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，并且分泌表達(dá)華根霉脂肪酶。

4.權(quán)利要求3所述的黑曲霉基因工程菌的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

（1）獲得潮霉素抗性表達(dá)盒并克隆至目標(biāo)質(zhì)粒上，獲得潮霉素抗性的重組質(zhì)粒；

（2）分別擴(kuò)增華根霉的脂肪酶基因RCL、擴(kuò)展青霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動子Pgpdp和構(gòu)巢曲霉色氨酸合成酶C的終止子TtrpC，得到有強(qiáng)啟動子的RCL基因超表達(dá)盒；

（3）將所述RCL基因超表達(dá)盒插入潮霉素抗性的重組質(zhì)粒中，獲得含潮霉素篩選標(biāo)記的RCL基因超表達(dá)載體；

（4）將含潮霉素篩選標(biāo)記的RCL基因超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化工程農(nóng)桿菌，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將RCL基因超表達(dá)盒轉(zhuǎn)化到黑曲霉菌株中，獲得高表達(dá)脂肪酶的黑曲霉基因工程菌。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的黑曲霉基因工程菌的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

（1）利用PCR技術(shù)或限制性酶切技術(shù)獲得潮霉素抗性表達(dá)盒并克隆至質(zhì)粒pCHAMBIA2300上，獲得潮霉素抗性的重組質(zhì)粒pCHAMBIA2302；

（2）利用RT-PCR技術(shù)從華根霉RNA中獲得華根霉脂肪酶的編碼基因RCL，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增構(gòu)巢曲霉色氨酸合成酶C的終止子TtrpC，然后利用重疊延伸PCR技術(shù)獲得RCL-TtrpC的融合片段，將該融合片段克隆至pMD18-T載體，構(gòu)建出pMD18-T：：RCL-TtrpC；

（3）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增擴(kuò)展青霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動子Pgpdp，然后克隆至pMD18-T：：RCL-TtrpC載體上，構(gòu)建出pMD18-T：：Pgpdp-RCL-TtrpC；

（4）利用限制性內(nèi)切酶將表達(dá)盒Pgpdp-RCL-TtrpC酶切出來，克隆至pCHAMBIA2302載體上，構(gòu)建出最終載體pCHAMBIA2302：：Pgpdp-RCL-TtrpC；

（5）將載體pCHAMBIA2302：：Pgpdp-RCL-TtrpC通過凍融法轉(zhuǎn)化工程農(nóng)桿菌EHA105，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將RCL基因超表達(dá)盒轉(zhuǎn)化到黑曲霉菌株中，獲得高表達(dá)脂肪酶的黑曲霉基因工程菌。

6.一種華根霉脂肪酶的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括培養(yǎng)權(quán)利要求3所述的黑曲霉基因工程菌，從培養(yǎng)體系中獲得華根霉脂肪酶。