[發明專利]一種固體發酵來源的液體復合酶的制備方法及其用途

有效

• 申請號: 201410275822.0
• 申請日: 2014-06-19
• 公開（公告）號: CN104017790A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 顏鵬飛
• 申請（專利權）人: 顏鵬飛
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N9/40;C12N9/28;A23K1/165;C12R1/885;C12R1/69;C12R1/685;C12R1/07
• 代理公司: 北京東方匯眾知識產權代理事務所(普通合伙) 11296
• 代理人: 白潔

技術領域

本發明涉及一種固體發酵來源的液體復合酶的制備方法及其用途，屬于飼料復合酶。

背景技術

飼用復合酶在實際生產中的使用越來越廣泛。飼用復合酶在形態上分為兩種：固體復合酶和液體復合酶。固體復合酶直接添加在飼料原料中混勻后進行制粒生產，液體復合酶在飼料制粒后噴涂在飼料表面。在酶源的生產方式上分兩種：固體發酵和液體發酵。固體復合酶同時具有兩種生產方式：固體發酵和液體發酵；液體復合酶只來源于液體發酵。固體發酵復合酶因其培養基為各種飼料原料的原因，其使用效果遠優于液體發酵復合酶。顆粒飼料中的固體復合酶與液體復合酶相比較，固體復合酶在高溫制粒過程中的酶活損失較大，有的高達90％，具體見表1；液體復合酶在高溫制粒后再進行噴涂，其酶活沒有任何損耗。因此固體發酵的液體酶使用效果明顯優于固體發酵固體酶和液體發酵液體酶。因此開發一種使用效果好的液體復合酶是十分必要的。另外液體發酵復合酶的酶解率為1.88％，酶解率很低。

表1?固體酶制劑在顆粒飼料制粒過程中的酶活保留

發明內容

本發明提供了一種固體發酵來源的液體復合酶的制備方法及其用途，解決了現有液體復合酶只來源于液體發酵，使用效果不好的問題。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案為：

一種固體發酵來源的液體復合酶的制備方法，包括以下步驟：

第一步、固體發酵：將培養基在攪拌機內混合均勻，然后分裝到布袋中，121℃，30min，高壓濕熱滅菌，待培養基冷卻至25-35℃，將培養基倒入攪拌機中然后加入制備好的菌種攪拌均勻，攪拌均勻后放到曲盤中，平鋪均勻，厚度適中，為3-5cm，最后蓋上濕布，開啟控溫開關，控制溫度為29℃，發酵40-60h后，進行翻曲及補水，補水量為8-15％，然后再發酵72小時完成整個發酵過程，得到固體發酵醪；

第二步、液體醪液：在固體發酵醪中添加緩沖液得到液體醪液，緩沖液加入量為固體發酵醪重量的2-3倍；

第三步、過濾：將液體醪液過濾，得到酶液；

第四步、超濾濃縮：通過超濾方式對酶液進行濃縮，濃縮的倍數為2-3倍，得到濃縮酶液；

第五步、酶活檢測、復配：對濃縮酶液的酶活進行測定，然后根據復合酶的配方計算各種單酶的添加量，進行復配，稀釋到規定水平，得到液體酶半成品；

第六步、添加保護劑：在液體酶半成品中添加穩定保護劑，即得液體復合酶。

優選地：所述的菌種為長柄木霉菌粉、米曲霉菌粉、黑曲霉菌粉和解淀粉芽孢桿菌菌粉中的一種或者一種以上的混合物。

優選地：所述的緩沖液為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH為5.0～6.0。

優選地：所述的過濾采取三級過濾，液體醪液依次通過板框過濾、離心過濾和陶瓷膜過濾。所用的陶瓷過濾膜的孔徑為0.45μm。

優選地：所述的穩定保護劑為質量分數為60％的乳酸鈉水溶液，添加量為液體酶半成品重量的20-25％。

另外本發明也提供了一種液體復合酶的用途，本發明所制備的液體復合酶用于制備飼料的添加劑，采用噴涂的方法添加到飼料當中。

本發明所用的長柄木霉菌粉的制備方法：將長柄木霉接種于PDA固體培養基上，于28℃培養24-72h；待長出孢子后，將孢子接種于50mlPDA液體培養基中，28℃搖床培養24-72h，長成懸浮在液體中的棉絮狀菌絲，然后將此液體與事先滅菌的麩皮培養基混勻，放置在28℃，培養24-72h，待長出孢子后，根據孢子和水分多少加入碳酸鈣和淀粉(碳酸鈣：淀粉的重量比為3：2)混勻，使孢子數達到10¹²個/g，在30-45℃下真空烘干，即為長柄木霉菌粉，活菌數達到10¹²個/g，常溫保存待用。

米曲霉菌粉和黑曲霉菌粉與長柄木霉菌粉的制備方法相似，不在論述。

解淀粉芽孢桿菌菌粉的制備方法：將斜面試管保存的解淀粉芽孢桿菌用5-8mL無菌生理鹽水洗滌保菌斜面，至無菌三角瓶中搖勻即成菌懸液150mL，按10％體積將斜面培養物接種到種子瓶，在28℃，222rpm培養24-48h，將6-10％的種子液接種到發酵瓶中擴大培養24-72h得到發酵液。以體積比1：1的比例加入碳酸鈣和淀粉(碳酸鈣：淀粉的重量比為3：2)混勻，在30-45℃下真空烘干，即為解淀粉芽孢桿菌菌粉，活菌數達到10¹²個/g，常溫保存待用。