[發(fā)明專利]一種嵌合載體及其制備方法和應(yīng)用有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201410275218.8 | 申請日： | 2014-06-19 |
| 公開（公告）號： | CN104131034B | 公開（公告）日： | 2017-04-05 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 張輝;潘婷 | 申請（專利權(quán)）人： | 中山大學(xué) |
| 主分類號： | C12N15/85 | 分類號： | C12N15/85;C12N15/64;A61K48/00;A61P35/00 |
| 代理公司： | 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司44102 | 代理人： | 任重 |
| 地址： | 510006 廣東省*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 嵌合 載體 及其 制備 方法 應(yīng)用 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
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本發(fā)明涉及蛋白抗癌藥物，更具體地，涉及一種嵌合載體及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)
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一直以來，控制細(xì)胞生長分化中的表達或功能的細(xì)胞基因組中如果發(fā)生改變都被認(rèn)為是誘發(fā)腫瘤的主要原因。腫瘤的分子生物學(xué)研究旨在確定那些在各種腫瘤類型的基因改變，并闡明這些基因在腫瘤發(fā)生中的作用。其中，最常見的人類腫瘤突變的基因家族之一就是RAS基因。
正常生理情況下，在細(xì)胞受到外界刺激后激活EGFR等信號通路時，野生型的KRAS被活性EGFR等酪氨酸激酶磷酸化后短暫活化，活化后的KRAS可以激活該信號通路中的下游信號蛋白，而后KRAS迅速失活。KRAS激活/失活效應(yīng)是受控的。然而，突變型KRAS蛋白導(dǎo)致蛋白功能異常，在無EGFR活化信號刺激下仍處于激活狀態(tài)，其功能狀態(tài)不可控，導(dǎo)致腫瘤的持續(xù)增殖等。RAS基因就像體內(nèi)的一個“開關(guān)”，它在腫瘤細(xì)胞生長以及血管生成等過程的信號傳導(dǎo)通路中起著重要調(diào)控作用。正常的KRAS基因可抑制腫瘤細(xì)胞生長，而一旦發(fā)生突變，它就會持續(xù)刺激細(xì)胞生長，打亂生長規(guī)律，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。因為KRAS基因突變一般發(fā)生在腫瘤惡變的早期，并且原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的KRAS基因高度保持一致；一般認(rèn)為，KRAS基因狀態(tài)不會因治療而發(fā)生變化。因此，檢測KRAS基因突變是深入了解癌基因的情況、了解各種癌癥的發(fā)展預(yù)后和放化療療效的重要指標(biāo)，具有極其重要的臨床意義。?
在我國，胰腺癌一直以來都是我國人口死亡的十大惡性腫瘤之一，5年生存率不到5%，是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。近年來，在廣東地區(qū)，大腸癌已經(jīng)成為第二大癌癥殺手，有明顯增加的趨勢，其發(fā)病率和死亡率也明顯逐年上升。腫瘤細(xì)胞RAS基因突變率大約為25%，而胰腺癌，結(jié)腸癌和非小肺泡肺癌中分別達到90%，45%和35%。?
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一提供一種嵌合載體是通過將能夠與GTP-Kras特異性結(jié)合的Raf蛋白N端的RAS結(jié)合結(jié)構(gòu)域替換Vif蛋白的N端所得。?
本發(fā)明另外給出一種嵌合載體的制備方法，包括以下步驟：?
????S1.?Raf的蛋白結(jié)構(gòu)上有一個特異性結(jié)合GTP-KRAS的RAS結(jié)合結(jié)構(gòu)域RBD，將這個RBD結(jié)構(gòu)域替換Vif蛋白N端的1-79?位氨基酸序列，從而構(gòu)建了一個新的嵌合蛋白RBD-Vif-C；
????S2.?將嵌合載體克隆到表達載體pcDNA3.1上，通過轉(zhuǎn)染進行瞬時表達，
????S3.?從公司合成跨膜肽片段PTD，然后將其連接到pet-32a的大腸桿菌表達載體上
????S4.以RBD-Vif-C為模板進行PCR擴增，得到的PCR產(chǎn)物RBD-Vif-C連接到pet-32a的表達載體上，并且PTD位于RBD-Vif-C的N端，形成融合表達載體PTD-RBD-Vif-C
????S5.?將PTD-RBD-Vif-C的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，
????S6.?對轉(zhuǎn)化的大腸桿菌進行培養(yǎng)，
????S7.?經(jīng)鎳柱純化，得到單一的PTD-RBD-Vif-C蛋白，
????其中，S6中，所述培養(yǎng)是將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌單菌落接種至含氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜；再按1:50體積比接種到37℃預(yù)熱的含氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600達0.6；表達PTD-RBD-Vif-C蛋白加入IPTG至終濃度為0.4mmol/L，經(jīng)誘導(dǎo)后收集菌體，
????S7中，所述純化的方法是將總菌體用PBS?Buffer洗滌，重懸，超聲處理后，高速離心獲得裂解上清液，經(jīng)鎳柱親和層析純化，收集洗脫的蛋白。
??本發(fā)明提供一種上述的嵌合載體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。?
??所述的腫瘤為胰腺癌腫瘤、大腸癌腫瘤或肺癌腫瘤。?
??本發(fā)明另外提出一種上述的嵌合載體在制備降解突變KRAS的藥物中的應(yīng)用。?
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