[發(fā)明專利]一種嵌合載體及其制備方法和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410275218.8
• 申請日: 2014-06-19
• 公開（公告）號: CN104131034B
• 公開（公告）日: 2017-04-05
• 發(fā)明（設計）人: 張輝;潘婷
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/64;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司44102
• 代理人: 任重

1.一種嵌合載體，其特征在于，是通過將能夠與GTP-Kras特異性結合的Raf蛋白N端的RAS結合結構域替換Vif蛋白的N端所得。

2.一種嵌合載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

???S1.?Raf的蛋白結構上有一個特異性結合GTP-KRAS的RAS結合結構域RBD，將這個RBD結構域替換Vif蛋白N端的1-79?位氨基酸序列，從而構建了一個新的嵌合蛋白RBD-Vif-C；

???S2.?將嵌合載體克隆到表達載體pcDNA3.1上，通過轉(zhuǎn)染進行瞬時表達，

???S3.?將跨膜肽片段PTD連接到pet-32a的大腸桿菌表達載體上,

???S4.以RBD-Vif-C為模板進行PCR擴增，得到的PCR產(chǎn)物RBD-Vif-C連接到pet-32a的表達載體上，并且PTD位于RBD-Vif-C的N端，形成融合表達載體PTD-RBD-Vif-C,

???S5.?將PTD-RBD-Vif-C的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，

???S6.?對轉(zhuǎn)化的大腸桿菌進行培養(yǎng)，

???S7.?經(jīng)鎳柱純化，得到單一的PTD-RBD-Vif-C蛋白，

????其中，S6中，所述培養(yǎng)是將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌單菌落接種至含氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜；再按1:50體積比接種到37℃預熱的含氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600達0.6；表達PTD-RBD-Vif-C蛋白加入IPTG至終濃度為0.4mmol/L，經(jīng)誘導后收集菌體，

????S7中，所述純化的方法是將總菌體用PBS?Buffer洗滌，重懸，超聲處理后，高速離心獲得裂解上清液，經(jīng)鎳柱親和層析純化，收集洗脫的蛋白。

3.根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的融合表達載體PTD-RBD-Vif-C的序列如SEQ?NO:1所示，從N端到C端的結構分別為，跨膜肽PTD部分，RBD的Kras結合部位，Vif-C的降解部分。

4.一種根據(jù)權利要求1所述的嵌合載體在制備抗腫瘤藥物中的應用。

5.根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于，所述的腫瘤為胰腺癌腫瘤、大腸癌腫瘤或肺癌腫瘤等KRAS相關的腫瘤。

6.一種根據(jù)權利要求1所述的嵌合載體在制備降解突變KRAS的藥物中的應用。