[發明專利]一種桉樹焦枯病原菌的LAMP檢測試劑盒及其使用方法

有效

• 申請號: 201410273167.5
• 申請日: 2014-06-18
• 公開（公告）號: CN104164486A
• 公開（公告）日: 2014-11-26
• 發明（設計）人: 朱天輝;張靜;朱涵明月;李姝江;譙天敏;韓珊;王淋敏;張麗娜
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及的是一種桉樹焦枯病原菌的LAMP檢測試劑盒及其使用方法。

背景技術

桉樹(Eucalyptus?spp.)是桃金娘科(Myrtaceae)桉樹屬植物的總稱，是世界著名的速生樹種，也是我國重要的三大速生用材樹種之一。由于其具有品質優良，生長迅速，適應性強，用途廣泛，以及較高的經濟回報效率等特點而被在我國廣泛引種，并大量栽培于廣東、廣西、福建、四川、云南、海南等南方地區。目前，由Cylindrocladium?scoparium(桉樹焦枯病原菌)引起的桉樹焦枯病被定義為一種世界性病害，嚴重威脅著澳大利亞、美國、中國、巴西、日本、印度尼西亞、泰國、越南等幾十個桉樹種植較為密集的國家。桉樹焦枯病主要侵害桉樹4齡及其以下的苗木，桉樹焦枯病原菌侵染植株林區后，輕者易造成植株萎蔫及落枝、落葉等現象；重者則會出現感病苗木葉片全部脫落、頂枯、植株枝條全部枯死等現象，危害十分嚴重。由于桉樹焦枯病可造成嚴重的經濟損失，嚴重影響桉樹生產林的建設，因此我國在1996年1月5日便將其列入森林植物檢疫對象。因此檢測桉樹是否攜帶焦枯病原菌對于桉樹焦枯病的防治意義重大，同時也是減少桉樹經濟損失的重要保障。

目前，經報道，在中國廣西、福建、海南、四川等多個省市和地區具有桉樹焦枯病的發生，其病原菌主要以Cylindrocladium?scoparium(桉樹焦枯病原菌)為主。桉樹焦枯病發生面積甚廣，已嚴重威脅著中國現今桉樹的林業生產建設。為此，亟需建立快速靈敏的檢測方法，為桉樹焦枯病的防治提供依據。

近年來，分子生物學技術發展迅速，已廣泛應用于植物病原真菌的分類鑒定中。PCR技術及基于PCR的檢測方法快速、準確、靈敏，在植物病害的檢測上發揮著不可替代的作用。LAMP(Loop-mediated?isothermal?amplification)，又稱“環介導等溫擴增反應”，是日本學者Notomi等發明的一種新型、快速、簡便的核酸擴增方法，其原理是利用一種鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件(一般在60-65℃之間)反應30-75分鐘，即可實現核酸的快速擴增，目前已被廣泛的應用于細菌、病毒、寄生蟲的快速檢測，但在真菌上的應用報道相對較少。與常規的PCR反應相比，LAMP方法操作簡單，不需昂貴的PCR反應儀器即可實現病原菌的快速檢測，且判斷結果更為人性化，僅需加入熒光染色劑用肉眼判斷，特異性和靈敏度也相對常規PCR反應高。

迄今為止，國內外對桉樹焦枯病原菌在快速檢測方面的報道仍處于空白，因此建立高效、快速的桉樹焦枯病原菌(Cylindrocladium?scoparium)LAMP檢測技術勢在必行，同時為桉樹焦枯病的發生和防治提供重要的技術手段。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術在檢測桉樹焦枯病原菌中存在的不足，提供了一種桉樹焦枯病原菌的LAMP檢測試劑盒及其使用方法。

本發明的技術方案如下：

一種桉樹焦枯病原菌的LAMP檢測試劑盒，其包括：

(1)10×ThermopolⅡ；

(2)100mMMgCl₂；

(3)2.5mMdNTPs；

(4)5M甜菜堿溶液；

(5)ddH₂O；

(6)40μM的內引物FIP和BIP，10μM的外引物F3和B3；10μM的環狀引物LooPF和LooPB；其中，前內引物FIP的序列為5＇－TGCGCGCTCTTTCGCTACATACACAACGGTACCTCCGACC－3＇，后內引物BIP的序列為5＇－CGCTCACCCTGCGAGAAACAGCGCGAGGAACATACTTGTT－3＇，前外引物F3的序列為5＇－CTCGACAGCAATGGTGTCT－3＇，后外引物B3的序列為5＇－GCTCAAGATCGACGAGGAC－3＇，環狀引物LooPF的序列為5＇－GTAGACGTTCATGCGCTCC－3＇，環狀引物LooPB的序列為5＇－ATTATTTGTGAGTGTGATAG－3＇；

(7)8UBstDNA聚合酶大片；

(8)SYBRGreenI熒光染料。

所述的LAMP檢測試劑盒的使用方法，其步驟如下：

(1)提取純培養菌株基因組DNA或所取植物組織樣總DNA；