[發明專利]一種桉樹焦枯病原菌的LAMP檢測試劑盒及其使用方法

有效

• 申請號: 201410273167.5
• 申請日: 2014-06-18
• 公開（公告）號: CN104164486A
• 公開（公告）日: 2014-11-26
• 發明（設計）人: 朱天輝;張靜;朱涵明月;李姝江;譙天敏;韓珊;王淋敏;張麗娜
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

1.一種桉樹焦枯病原菌的LAMP檢測試劑盒，其特征在于，其包括：

(1)10×ThermopolⅡ；

(2)100mMMgCl₂；

(3)2.5mMdNTPs；

(4)5M甜菜堿溶液；

(5)ddH₂O；

(6)40μM的內引物FIP和BIP，10μM的外引物F3和B3；10μM的環狀引物LooPF和LooPB；其中，前內引物FIP的序列為5＇－TGCGCGCTCTTTCGCTACATACACAACGGTACCTCCGACC－3＇，后內引物BIP的序列為5＇－CGCTCACCCTGCGAGAAACAGCGCGAGGAACATACTTGTT－3＇，前外引物F3的序列為5＇－CTCGACAGCAATGGTGTCT－3＇，后外引物B3的序列為5＇－GCTCAAGATCGACGAGGAC－3＇，環狀引物LooPF的序列為5＇－GTAGACGTTCATGCGCTCC－3＇，環狀引物LooPB的序列為5＇－ATTATTTGTGAGTGTGATAG－3＇；

(7)8UBstDNA聚合酶大片；

(8)SYBRGreenI熒光染料。

2.根據權利要求1所述的LAMP檢測試劑盒的使用方法，其特征是，其步驟如下：

(1)提取純培養菌株基因組DNA或所取植物組織樣總DNA；

(2)所述的反應體系50μL，包含：10×ThermopolⅡ2.5μl；100mMMgCl₂2μl；2.5mMdNTPs3.5μl；5M甜菜堿溶液3.0μl；ddH₂O33.0μl；40μM內引物FIP/BIP各1μl；10μM外引物F3/B3各0.5μl；10μM環狀引物LooPF/LooPB各1μl；8UBstDNA聚合酶大片1μl；加純培養菌株基因組DNA或所取植物組織樣總DNA提取液2.0μL，組成反應混合液；

(3)PCR反應條件為：將反應混合液置于65℃的水浴鍋中反應65min，隨后80℃滅活3min結束反應；

(4)結果判定：①用肉眼觀察反應液是否為白色渾濁，白色渾濁即為陽性，否則為陰性；②將反應產物PCR管放在紫外燈下照射，若有白色則說明樣品中存在桉樹焦枯病原菌，無白色則說明不含桉樹焦枯病原菌；③在擴增產物中加入SYBRGreenI熒光染料觀察顏色變化，反應液顏色由橙色變成綠色為陽性，顏色保持不變為陰性；④擴增結束后取5.0μLPCR產物上樣于含0.5μg/mLEB的2％瓊脂糖凝膠上電泳，電壓為9V/cm、時間為30min，在凝膠成像系統上檢測并拍照，觀察是否產生特征性梯狀電泳條帶，有條帶則說明樣品中存在桉樹焦枯病原菌，無條帶則說明不含桉樹焦枯病原菌。