[發(fā)明專利]一種基因治療用載體蛋白及其制備方法和用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410272758.0
• 申請日: 2014-06-19
• 公開（公告）號: CN104031134A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 艾永興;吳山力;鄧晨;鄭海南;趙程程;于佩峰;王夢云;郝林琳;于浩;張玉靜
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K14/00;C12N15/10;A61K48/00;A61K47/42;A61P35/00
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責(zé)任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明提供一種基因治療用載體蛋白及其制備方法，是可以與治療性基因表達質(zhì)粒結(jié)合的蛋白，作為基因治療用載體蛋白。同時還公開了該蛋白的制備方法，并應(yīng)用此蛋白對多種腫瘤細胞進行效應(yīng)研究，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

目前用于基因治療載體主要有兩大類，即病毒衍生載體和非病毒載體。

病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，但是存在整合入人體基因組的危險及機體免疫反應(yīng)，廣泛應(yīng)用于臨床還需解決這些危險問題。

非病毒載體主要包括化學(xué)聚合物衍生載體和蛋白/多肽類衍生載體。目前化學(xué)聚合物衍生載體轉(zhuǎn)染效率與病毒載體相當(dāng)，但是免疫原性強，機體不易降解與清除，靶向性差，限制其應(yīng)用。

蛋白/多肽類載體可分成天然蛋白類與合成蛋白類。合成蛋白類載體包括多聚精氨酸、多聚組氨酸等，依靠其所帶正電荷與DNA結(jié)合，攜帶其進入細胞。這類蛋白/多肽類載體因其具有較強的免疫原性，不適于應(yīng)用于臨床。另外一類源于生物體表達的天然蛋白，他們通過特定空間結(jié)構(gòu)與DNA結(jié)合，攜帶這些DNA進入細胞后，載體蛋白隨著蛋白質(zhì)體內(nèi)降解途徑被機體降解為氨基酸后，為機體所再利用，既無細胞毒性。如果這些蛋白為生物體內(nèi)高度保守的蛋白，則免疫原性低，不引起免疫反應(yīng)，也不易在血漿中降解，有利于維持血漿中的濃度。再者，蛋白/多肽類載體易與功能性多肽融合而獲得諸如靶向性等優(yōu)點。蛋白/多肽類載體的低毒性、低免疫原性、易獲得靶向性、開發(fā)及制備成本低等優(yōu)點成為基因載體的研究熱點。

目前天然的蛋白/多肽類載體多采用組蛋白H1、組蛋白H2A、魚精蛋白等高度保守的DNA結(jié)合蛋白為核心構(gòu)件，融合促進轉(zhuǎn)染的功能結(jié)構(gòu)域，制備成融合蛋白。但是這些蛋白與合成蛋白類載體相比體積較大，又具有多個非DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，諸如與蛋白分子結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，使得載體蛋白之間易于相互結(jié)合，形成聚合物，是導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率不高的原因之一。再者，蛋白/多肽類載體的跨膜及運輸作用機制，尚不十分明確，需要制備多種不同種類的蛋白/多肽類載體，并加以研究，獲得大量實驗數(shù)據(jù)，進而闡明載體蛋白轉(zhuǎn)運的作用機制。況且蛋白分子中的非DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的存在，在細胞內(nèi)表現(xiàn)出與多種蛋白/因子結(jié)合，使得機制研究變得更加復(fù)雜，將單一DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與多種轉(zhuǎn)染相關(guān)功能結(jié)構(gòu)域融合，是研究蛋白/多肽類載體特定結(jié)構(gòu)域功能的有效途徑，為蛋白轉(zhuǎn)染機制的研究提供豐富的材料與數(shù)據(jù)。

本發(fā)明采用人源組蛋白H4中一個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（H4^67-103）作為蛋白/多肽載體的核心結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在生物體中保守性極高，從植物中獲取基因，略加改造就獲得與人完全一致的蛋白序列。該結(jié)構(gòu)維持其天然的構(gòu)象，既可以有效結(jié)合DNA，免疫原性又低，是個理想的用于基因載體構(gòu)建的元件。將H4^67-103與多種已知的促進轉(zhuǎn)染的功能結(jié)構(gòu)域相融合，即可構(gòu)建出低毒的基因轉(zhuǎn)運蛋白。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明提供一種人源H4^67-103多肽，作為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域用于構(gòu)建基因轉(zhuǎn)運載體。

本發(fā)明進一步提供H4^67-103多肽基因的獲取方法。

本發(fā)明進一步提供載體蛋白，具有與質(zhì)粒DNA結(jié)合，具有將質(zhì)粒運輸?shù)侥[瘤細胞的特征。

本發(fā)明進一步提供了上述載體蛋全長基因的獲取方法。

本發(fā)明進一步提供了載體蛋白的原核表達質(zhì)粒構(gòu)建、載體蛋白原核表達、純化及功能驗證等詳細方法。

本發(fā)明提供的人源H4^67-103多肽作為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域用于構(gòu)建基因轉(zhuǎn)運載體的用途，

其中，所述的人源H4^67-103多肽的氨基酸序列如下：SEQ?no.1。

本發(fā)明所述的人源H4^67-103多肽的基因的獲取方法，包括以下步驟：

1）提取全小麥基因組；

2）以小麥全基因組為模板設(shè)計引物，在引物中替換個別核苷酸，使得所擴增的產(chǎn)物所編碼的氨基酸序列與人源氨基酸序列一致；并在上游引物上添加酶切位點，用于原核表達載體構(gòu)建；

所用引物為：

上游引物：?

ATGGCTAGCA?TCCGCGACGC?CGTCACCTAC?ACCGAGCACG?CCAAGCGCAA?GACCGTC；

下游引物：

ACGTGAATTCTTAGCCGCCGAAGCCGTAG；