[發明專利]一種基因治療用載體蛋白及其制備方法和用途

有效

• 申請號: 201410272758.0
• 申請日: 2014-06-19
• 公開（公告）號: CN104031134A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發明（設計）人: 艾永興;吳山力;鄧晨;鄭海南;趙程程;于佩峰;王夢云;郝林琳;于浩;張玉靜
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K14/00;C12N15/10;A61K48/00;A61K47/42;A61P35/00
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

1.人源H4^67-103多肽作為DNA結合結構域用于構建基因轉運載體的用途，所述的人源H4^67-103多肽的氨基酸序列如下：SEQ?no.1。

2.?根據權利要求1所述的人源H4^67-103多肽的基因的獲取方法，包括以下步驟：

1）提取全小麥基因組；

2）以小麥全基因組為模板設計引物，在引物中替換個別核苷酸，使得所擴增的產物所編碼的氨基酸序列與人源氨基酸序列一致；并在上游引物上添加酶切位點，用于原核表達載體構建；

所用引物為：

上游引物：?

ATGGCTAGCA?TCCGCGACGC?CGTCACCTAC?ACCGAGCACG?CCAAGCGCAA?GACCGTC；

下游引物：

ACGTGAATTCTTAGCCGCCGAAGCCGTAG；

以小麥全基因組為模板，上述兩條引物，PCR法擴增得到人源H4^67-103多肽基因序列。

3.?一種載體蛋白，其特征在于：

是以人源H4^67-103多肽為DNA結合結構域、融合多種功能多肽的基因載體蛋白，具有與質粒DNA結合并且將質粒運輸到腫瘤細胞的特征；

載體蛋白序列由以下幾部分構成：N端起始為His6-H4^67-103-NLS-Tat-AHNP；

其氨基酸序列如下：

SEQ?no.2。

4.?權利要求3所述載體蛋白的基因獲取方法，具體步驟如下：

1）引物設計

上游引物：?

ATGGCTAGCA?TCCGCGACGC?CGTCACCTAC?ACCGAGCACG?CCAAGCGCAA?GACCGTC；

下游引物為兩條長引物

下游引物1:

TTCCTGCCAT?ATGAACCGCC?TCCACCTGGT?TTCTTCTTTG?GCTGGGGGCC?GCCGAAGCCG；

下游引物2:

CCGCAAGCTT?TTAGTACCAC?GGCGAGACGG?TGAGTCTTCG?TCGCTGTCTC?CGCTTCTTCC????????TGCCATATGA?ACC；

2）以人源H4^67-103?多肽PCR擴增產物為模板，用上游引物和第一條下游引物組合，PCR擴增出部分載體蛋白基因序列；

再以該PCR產物為模板，通過上游引物和第二條下游引物擴增出載體蛋白基因全長。

5.?權利要求3所述載體蛋白的制備方法，包括以下步驟：

1）原核表達質粒構建；

載體蛋白全長基因PCR擴增產物雙酶切（Nhe?Ⅰ和Hind?Ⅲ）后，凝膠回收雙酶切產物；

pET28a表達質粒雙酶切（Nhe?Ⅰ和Hind?Ⅲ）后，凝膠回收大片段；

將上述兩個回收片段連接，獲得將載體蛋白全長基因構建入pET28a表達載體中的重組質粒，既載體蛋白原核表達質粒；

2）載體蛋白原核表達

將步驟1）的載體蛋白原核表達質粒導入到BL21（DE3）原核表達菌體系，37℃?終濃度0.1?mM?IPTG誘導表達載體蛋白；

3）載體蛋白原核表達產物純化

變性條件下，Ni親和層析一步法純化步驟2）獲得的載體蛋白，透析后分裝凍存即得。

6.?權利要求3所述的載體蛋白在作為腫瘤基因治療用載體的用途。